热点综述：体内CAR-T细胞的工程化

经改造表达智能化设计的嵌合抗原受体（CARs）T细胞是治疗复发难治性血液瘤的强有效的药物，并有望革新多种其他疾病的疗法。为规避体外制备的过继性细胞治疗产品大规模应用所伴随的复杂性和成本问题，通过直接输注纳米颗粒化的核酸类物质或正在开发的工程化病毒载体在体内生成CAR-T细胞的替代策略近年来受到了广泛的关注。我们概述了体外制备过程作为直接体内策略的理论框架，结合临床前模型的新兴数据，重点阐述体内方法的效力、新疾病适应症的适用性以及临床应用准备相关现存挑战，包括递送特异性、长期疗效和安全性问题。

利用合成受体对T细胞的靶向治疗重定向

CAR-T细胞疗法已成为治疗复发/难治性（r/r）B细胞恶性肿瘤的突破性方法。合成型CAR分子将靶向结构域（通常是抗体衍生的单链可变片段（scFv））与细胞内CD3ζ 以及共刺激结构域（如CD28或4-1BB）融合，从而引导T细胞靶向肿瘤表面表达的抗原。尽管该疗法在白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤的治疗中取得了巨大进展，但CAR分子的模块化特征赋予了其高度通用性，在临床前和临床管线中涌现出大量针对血液恶性肿瘤、实体瘤和非肿瘤（如自身免疫性疾病、传染病等）应用的新型CAR靶点和构建体。在过去10年中，创新型CAR设计和长期临床疗效的涌现已经确证了合成免疫受体的治疗效力。然而，这一成功带来了如何将定制化体外生产的细胞产品广泛应用于癌症适应症及其他领域的巨大挑战。在此，我们阐述了当前体外CAR-T细胞生产流程中的困难，并探讨两种技术进展：即封装CAR编码核酸的纳米颗粒和携带CAR的病毒载体，通过直接输注患者体内，来满足对通用型现货产品的迫切需求。

现行CAR-T细胞的生产模式

目前所有获批的CAR-T细胞产品及大多数处于临床测试阶段的细胞疗法均来自患者自体T细胞的体外制备。这种定制治疗需要多步流程，严格的质量管理系统以及专用的设施和设备（图1A）。由于病毒转导方法常用于将CAR转基因递送至T细胞，γ-逆转录病毒或慢病毒载体必须通过将源质粒引入生产细胞以产生病毒颗粒。通过白细胞分离技术收集患者的T细胞，将其运输至生产设施，在培养中通过CD3和CD28共刺激分子及细胞因子激活，实施病毒转导并扩增以产生包含数亿个修饰T细胞的个体化细胞产品。患者间个体差异（既往治疗可能加剧此差异性），及病毒的半随机整合和表达异质性均会导致产品质量和产量的波动以及整体治疗反应。在细胞修饰期间，患者接受淋巴细胞清除以促进修饰后细胞的植入存活并增强其功能。CAR-T细胞必须通过多种放行测试来确保其质量和安全性，然后被运输至治疗地并回输给患者。由于这一流程的复杂性，从T细胞采集到CAR-T细胞回输（采血到回输的时间）通常需要数周，而疾病快速发展的患者需要接受桥接治疗。已获批的商业CAR-T细胞产品的单例标价超过50万美元，额外的诊疗流程（包括预检测、白细胞分离术、淋巴细胞清除化疗治疗、可能的ICU收治和疗效评估[如PET/CT扫描或骨髓活检和流式细胞术]）的总成本超过100-150万美元（包括CAR细胞产品）。因此，患者定制化产品的可扩展性受到生产工艺和质量保证流程的复杂性以及由此产生的财务负担的限制，这些成为了公平性和可及性的障碍。

图1. 体外和体内细胞治疗的制造策略概述

通过体内CAR-T细胞工程化技术绕过体外生产步骤

合成免疫受体的体内递送技术有望变革癌症和许多其他疾病的治疗。该策略的实现得益于病毒载体工程技术以及非病毒核酸递送平台（如脂质纳米颗粒（LNPs）或聚合物基纳米颗粒）的进展（图1B）。在体内生成CAR修饰免疫细胞的现货型产品将具有简化生产流程、降低成本、改善治疗生物学特性和增加方法安全性相关的众多优势，但也会带来新的挑战（表1）。

表1. CAR基因信息递送平台总览

生成具有明确理化性质的单一载体或纳米颗粒药物产品可用于治疗多名患者，从而简化生产流程和放行测试、缩短供应链、降低成本，并为侵袭性疾病患者提供快速治疗。这一简化流程可促进广泛实施，从而普及可及性。

除了体内CAR-T细胞的物流优势外，该策略理论上还可以解决当前体外制备CAR-T细胞疗法的一些治疗挑战。体内CAR-T细胞治疗需要患者体内存在T细胞，因此无需淋巴细胞清除化疗及其相关的下游后遗症（包括感染并发症）。相应地，完整免疫系统的存在可能更好地支持表位扩散和广泛的抗肿瘤免疫应答的产生，从而形成对抗CAR靶抗原逃逸（即一种常见的治疗失败机制）的保障机制。体内CAR-T细胞平台的即用型特征，还可以通过多重使用LNP封装mRNA或病毒载体（相对于为体外CAR-T细胞设计双靶向病毒载体）来简化同步或序贯的多抗原靶向治疗。基于mRNA的体内CAR-T细胞因瞬时表达可能需要重复治疗，从而能够实时调整剂量以提高疗效或减少毒性反应，如细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。同时，瞬时CAR表达将限制携带CAR阳性T细胞中耗竭，这是CAR-T细胞治疗失败的另一个主要机制，由慢性抗原刺激、持续性信号传导和微环境介导的外源性免疫抑制引起。序贯给药可形成内置休息期，这策略已被证实在双特异性分子治疗和CAR-T细胞治疗期间能最大化T细胞功能。体外制备的CAR-T细胞仅采集循环系统中的少量T细胞，而体内治疗理论上可以接触具有各种分化状态和特性的T细胞（如组织驻留记忆T细胞），这些可能具有治疗优势。最后，由于体外扩增和暴露于超生理水平的细胞因子可加速T细胞分化和耗竭，快速制备低修饰CAR-T细胞的方案已被证明可保留T细胞干性、促进优异的体内扩增能力，并使用剂量比常规方法生产的CAR-T细胞显著降低时仍能引发有效临床应答。可以推断，基于病毒载体的体内CAR疗法所重新定向的未修饰的T细胞应具有相同的优势。

遗传物质必须以足够的效率和细胞靶向特异性递送至目标细胞类型。脱靶递送可能导致有效成分稀释而削弱疗效，若肿瘤细胞遭意外转导或转染则可能引发表位掩蔽现象，此时CAR与顺式靶标结合反而阻碍与T细胞接触目标抗原。转导或转染具有抑制特性的旁观免疫细胞（如调节性T细胞）也可能加剧病情。

靶向T细胞的纳米颗粒和核酸类物质可在体内递送CAR遗传物质

颗粒载体、遗传载荷和靶向设计要素

为了保护核酸物质免于降解并实现体内递送至靶细胞，脂质纳米颗粒（LNP）和聚合物纳米颗粒均已被证明可成功将CAR编码核酸递送至T细胞和巨噬细胞。尽管无机纳米颗粒（如金、介孔二氧化硅和氧化铁）也已用于递送核酸，但其在CAR-T细胞疗法中的应用尚未见报道。LNPs是由四种组分脂质构成：可电离阳离子脂质、包括磷脂和胆固醇的辅助脂质，以及聚乙二醇（PEG）缀合脂质（图2左图）。在生物体液中，LNPs获得吸附在表面的蛋白冠，如载脂蛋白E（ApoE），并通过内吞作用被细胞摄取，将mRNA物质释放到胞质中进行翻译。使用SATA-马来酰亚胺化学修饰法，可以在LNP表面装配靶向抗体（如抗CD4或CD5）从而特异性来增强与T细胞的结合和内吞。可生物降解的聚（β-氨基酯）（PBAE）聚合物制剂带正电，通过静电相互作用与带负电的核酸（DNA或mRNA）自我组合，并实现pH依赖性内体逃逸。为了将这些颗粒靶向T细胞，聚谷氨酸与抗体（如抗CD8或CD3）偶联，并吸附于颗粒表面。对于这两种类型的纳米颗粒，受体介导的内吞作用增强了T细胞原本低效的内吞途径，但其增强程度因受体而异。

为了实现T细胞功能的瞬时重新定向，体外转录的mRNA已被封装在上述纳米载体中。mRNA表达盒是作为瞬时体内表达CAR的优选平台，因其设计简便其可通过无细胞方式经济高效的大规模生产。治疗性合成mRNA模拟内源性mRNA，包含5'端、5'非翻译区域（UTR）、编码CAR的开放阅读框、3'非翻译区域和多聚腺苷酸尾，通过密码子优化和修饰核苷（如N1-甲基假尿苷）的引入，最大限度降低模式识别受体（PRR）激活并提升翻译效率。尽管疫苗和体内CAR应用优选源自α和β珠蛋白基因的UTRs，但UTR设计元件在不同应用场景中的优化仍在探索中，UTR工程化提供了增强T细胞表达强度和持续时间，并减少脱靶细胞类型的表达。LNPs可同时包载mRNA和siRNA，为实现T细胞重编程并抑制负向调控信号，，已实现CD19 CAR mRNA和PD-1 siRNA的共递送。令人惊讶的是，尽管如先前报道的共载的RNA组分存在相互作用，但两种RNA联合使用时表达水平和基因敲除效果均优于单一RNA。研究报道采用质粒DNA编码CAR通过LNP和聚合物纳米载体实现CART细胞的离体与体内重编程。为了增强CAR的持久性，将CAR基因两侧连接piggyBac反向末端重复序列（ITRs）构建转座子系统，并与编码超活性iPB7转座酶的质粒共同封装，从而实现CAR稳定整合到基因组中。

图2. 体内细胞治疗平台和细胞重定向机制的剖析

纳米载体和核酸类物质的优势与挑战

非病毒策略，特别是mRNA-LNP方法（尚未有聚合物基mRNA递送系统获得监管批准），利用已建立的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）疫苗生产能力、冷链协议和已验证的安全性。此外，纳米颗粒和mRNA具有无细胞生产的优势并具有明确的理化性质，能最大限度降低产品批次间差异。最后，由于mRNA被递送至细胞质后直接翻译，该给药方式不会带来插入突变的风险。

至今为止，大多数使用纳米颗粒（LNPs和其他纳米载体）在体内生成CAR-T细胞的研究都使用了靶向配体的标记技术。然而，偶联过程需采用复杂的偶联程序，这不仅使制备过程复杂化，还会降低了颗粒的产量和稳定性，且无法实现冷冻产品的长期储存。或者，通过调整LNP脂质成分可以增强多种细胞类型，包括离体T细胞或体内目标组织的转染效率。结合修饰mRNA UTR可在靶细胞类型中实现第二层表达调控，LNP脂质成分和mRNA设计的协同作用有望规避抗体靶向策略该策略正是制约可拓展性的关键障碍。

目前尚不清楚CAR需要持续表达多久才能产生治疗益处；这将取决于适应症的特性、被转染T细胞的比例以及所需达到的靶细胞群清除深度。可能需要多次给药或采用辅助手段来维持CAR的表达。对于LNP系统，多重设计要素有望攻克这一障碍。优化脂质组成可以改善循环半衰期和基因表达水平，改变LNP的制剂参数可以增强mRNA完整性并提高转染效率。例如，我们已经证实，在高浓度pH 4缓冲液下制备LNPs会形成富含mRNA的囊泡结构，该结构能有效保护mRNA并增强转染效果。尽管尚未见体内CAR应用的文献报道，但其他RNA种类，如自扩增或环状RNA在疫苗领域已被证实可以延长目的基因的表达时间，也有望通过单次RNA给药提升治疗效果。其他方法，如共同封装需谨慎采用编码CAR两侧为ITRs的DNA质粒和PiggyBac转座酶制备CAR-T细胞群的方案，应谨慎对待，因为据报道，使用类似方法体外制造的CAR-T细胞的一小部分会导致T细胞淋巴瘤。

LNPs已被证明可作为mRNA疫苗的佐剂成分，不同的可电离脂质具有不同的免疫刺激特性。尽管这一特性在疫苗应用中可能成为LNPs的优势，但在针对不应引发适应性免疫反应的靶点进行重复给药时（如针对CAR），这特性可能无益。然而，初步结果看起来是有利的，在小鼠中重复给药编码CRISPR/Cas 9的LNP mRNA显示了对杜氏肌营养不良的累积疗效，重复给药编码精氨酸酶1的LNP mRNA显示了对精氨酸酶缺乏症治疗中也呈现的累积益处。编码人鸟氨酸转氨甲酰酶（hOTC）的LNP mRNA的连续给药在非人灵长类动物中显示持续性表达。

T细胞靶向病毒载体可在体内递送CAR遗传物质

病毒载体、基因载荷和靶向设计元素

体内CAR-T细胞治疗主要探索两类病毒载体，腺相关病毒（AAV）和复制缺陷型慢病毒或逆转录病毒，其中慢病毒是最常见的平台（图2，右图）。当T细胞在体外转导以制备CAR-T细胞时，慢病毒通常用水泡性口炎病毒糖蛋白（VSVG）假型化修饰，其可与低密度脂蛋白受体（LDLR）结合。LDLR的分布广泛，对于纯化细胞群的工程化而言，是有效的。然而，对于静脉给药的体内应用，多种细胞类型可能被转导。向野生型小鼠注射携带CD19 CAR的VSVG假型化慢病毒后可转导少量T细胞，这些细胞获得选择性优势并增殖，在给药后3-4周达到所有T细胞总量的13%，并导致B淋巴细胞被完全清除。为了最大化T细胞的转导效率，已开发了具有修饰包膜蛋白的替代假型化策略。为此，已使用了多种病毒包膜蛋白，包括麻疹病毒、尼帕病毒、辛德比斯病毒等。在这些情况下，慢病毒也被设计为表达靶向配体，可与包膜蛋白融合或独立存在，以促进T细胞趋向性（见框3中的案例研究）。配体以scFv、纳米抗体或设计的锚蛋白重复蛋白（DARPin）的形式存在，通过靶向T细胞表面分子（如CD3、CD4或CD8）介导T细胞结合，而假型糖蛋白装置在靶标结合后启动膜融合过程。尽管麻疹病毒F和H包膜假型慢病毒的产量低，但尼帕病毒糖蛋白已被证明可产生更高的病毒滴度，并且由于病毒血清阳性率低，不会被血清抗体广泛中和。除依赖于配体靶向转导外，逆转录病毒的生物学也被利用来选择性转导T细胞。通过植入载有固定化抗CD3和抗CD28抗体以及编码CAR转基因的逆转录病毒颗粒的多功能支架，T细胞可在原位同步激活并在原位完成转导。与膜包被病毒的慢病毒不同，AAVs具有衣壳，但可以修饰以展示scFv或DARPin。

慢病毒和AAV现已广泛用于治疗领域，且符合临床级生产标准的操作流程与试剂体系已相当成熟。慢病毒载体可实现CAR转基因的稳定整合和表达，尽管AAV不发生整合，但其游离基因表达可以维持数周至数月甚至数年，从而产生具有长期存续潜力的细胞产品。慢病毒和AAV均可转导分裂和静止期细胞。最后，慢病毒基因组的载体工程已得到充分研究，其能够容纳多顺反子盒，不仅能实现T细胞靶向重定向，还同步递送增强T细胞功能的基因。典型案例如CD19 CAR和合成细胞因子受体的共递送系统，该受体由外源雷帕霉素调控，可模拟IL-2和IL-15生长信号通路。

而慢病毒基因转移的永久性特征要求对体内转导的细胞类型实施极其严格的控制标准。生殖细胞的基因转移存在种系转化的风险，对于有生殖能力或未来可能有生殖能力的个体必须完全避免此类操作。在体细胞中，转基因的插入可能破坏整合位点宿主基因的表达，如果转基因整合到其调控DNA区域时，还会通过改变远端基因的的调控机制诱发细胞转化。历史上，基于白血病病毒（MLV）的第一代载体在治疗X连锁重症联合免疫缺陷症（X-SCID）时曾引发灾难性后果，多名患者因载体整合至原癌基因位点附近，其病毒长末端重复（LTRs）固有启动子活性导致LMO2基因失调，最终发展为T细胞淋巴瘤。后续对病毒载体的重新设计以及使用自灭活（SIN）γ-逆转录病毒和慢病毒载体（其中LTRs的启动子元件被消除）似乎已经消除了插入性肿瘤发生。体外生产的细胞因病毒介导转化导致继发性恶性肿瘤的风险受到了显著的关注，但该风险被认为极低并被CAR-T细胞治疗的益处所超过。尽管尚不清楚转导是否具有致癌性（因带有遗传异常的克隆似乎在治疗前就已存在），但已报告了两例表达CAR的继发性T细胞恶性肿瘤的罕见病例。与体外转导成熟T细胞相关的致癌风险也存在于体内环境中，此外，体内转导可能作用于罕见的非靶向原始干细胞，这些细胞可能带有随机或种系遗传异常。一个体外制造的CAR-T细胞的案例为此提供了佐证，当患者另一等位基因存在种系亚效等位基因突变时，CAR-T细胞中TET2等位基因因载体整合而失活，导致该细胞克隆到显著扩增。尽管在这种情况下TET2基因失活与强劲的治疗反应相关，但TET2的缺失也被证明会增强T细胞对基因组不稳定性和恶性转化风险。

体内细胞治疗的适应症：癌症及其他领域

降低成本和免除淋巴细胞清除预处理可扩大了CAR技术应用于传染病、自身免疫疾病或纤维化的实际现实和范围，在这些领域通常无法承受癌症治疗特有的毒性反应。事实上，这些情况中测试体内CAR-T细胞策略最为适宜，尤其是针对尚未有获批的CAR-T细胞产品的适应症。除了血液肿瘤，CD19 CAR平台的第一个合乎逻辑的延伸应用便是清除驱动自身免疫疾病（如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、天疱疮、多发性硬化症和硬皮病）的自身反应性B淋巴细胞。这些疾病领域虽已采用广谱免疫抑制剂和靶向B细胞的单克隆抗体疗法，但收效甚微。众所周知，虽然单克隆抗体可以有效消除循环系统中的B细胞，但对组织驻留B细胞作用有限，而具有组织归巢能力的CAR-T细胞可能更适用于靶向清除这类细胞。目前，CAR-T细胞治疗系统性红斑狼疮（SLE）已进入临床试验阶段。对于这些临床症状可能反映永久性器官损伤（如SLE中的肾脏损伤）的自身免疫疾病，在疾病管理早期实施体内CAR方法将是合乎逻辑的。同样的，使用CAR-T细胞清除衰老细胞或导致纤维化的活化成纤维细胞时，理想情况下应在疾病早期使用，此时淋巴细胞清除是不可接受的副作用。这些适应症对疗效门槛要求低，其中目标是显著减少靶细胞（如正常B细胞），而不是完全清除所有恶性B淋巴细胞。CAR-T细胞治疗也在研究用于治疗传染病，包括HIV和乙型肝炎病毒，首批患者已接受使用靶向艾滋病 gp120糖蛋白的CAR-T细胞的试验治疗。在传染性疾病领域，体内细胞治疗具有许多优势。全球有超过3800万人患有艾滋病：虽然制造自体细胞产品治疗如此规模的患者在财务或物流上是不可能的，但SARS-CoV-2疫苗已证明mRNA和LNPs技术可满足该量级应用需求。淋巴细胞清除不仅会削弱抗病毒适应性免疫应答强度，更可能加剧病毒感染，因此支持在无需预处理的情况下即可施用的体内细胞治疗技术。

不同形式的体内治疗策略即核酸/纳米颗粒递送与病毒载体递送）对各适应症的适用性差异，仍需通过实证研究确定。CAR表达持久性很可能将取决于治疗该疾病所需清除的靶细胞群深度。例如，在只需降低活化成纤维细胞水平而非完全清除即可改善心功能的场景中，使用瞬时体内生成的抗成纤维细胞活化蛋白（FAP）CAR - T细胞具有很大的意义。相比之下，对于存在复发风险的恶性肿瘤，可能需要多次注射瞬时CAR mRNA或慢病毒永久转导才能实现根除。

CAR技术及更广义的合成生物学有可能改变医学实践的方式。这些策略已通过体外细胞工程技术率先实现，并取得了令人瞩目的临床成果，然而，患者定制化细胞产品的制备难题限制了该技术的应用。基于核酸类物质的纳米颗粒和病毒载体等递送平台使得通过原位细胞操作以治疗疾病成为可能。临床前概念验证研究已证明在肿瘤学和心脏损伤模型中，与常规体外生产的细胞功能等效。在未来，需要在免疫健全小鼠模型中深入解析影响肿瘤应答强度的免疫细胞类型动态机制，并阐明平台的免疫原性如何影响连续给药。使用免疫缺陷和/或重建人T细胞的人源化小鼠也将提供一个补充视角来评估人类临床候选物。最后，采用非人灵长类动物模型验证该方法的安全性，并建立剂量依赖性药效学和药代动力学特征。纳米医学领域已为多种疾病疗法开辟新途径，包括针对SARS-CoV-2病毒的疫苗接种。在体内治疗领域，LNP系统相对于病毒平台具有多重优势，包括成本效益、耐受性、可量产性和按效果给药的能力，然而所有方法面临的最大的挑战是CAR在非靶细胞类型中的表达。尽管如此，这仍是一个新兴领域，需要化学家、肿瘤学家、免疫学家、生物信息学家和法规科学家共同努力解决未决问题，推动这些技术转化为临床现实。

Lauralie Short, et al., Trends in Pharmacological Sciences, 2024 May; 45(5):406-18. Direct in vivo CAR T cell engineering.