Nature综述：炎症与肿瘤免疫中的细胞外基质诱导的信号

细胞外基质（ECM）是细胞之间填充的主要物质，它不仅建立了分隔不同组织区域的屏障，还决定了器官的形态与柔韧性。ECM是细胞微环境的重要组成部分，通过结合细胞因子和趋化因子等方式，向相关细胞传递大量生化（和机械）信号。所有细胞都与ECM接触，包括淋巴器官中的免疫细胞、血管外渗的免疫细胞，以及与血管ECM紧密接触的组织驻留髓系细胞。近十年，蛋白质组学和转录组学提供了大量关于ECM和免疫系统多样性的数据。结合对体内情况的认识对这一快速增长的数据集进行评估至关重要，尤其是结合近十年的活体成像研究成果。本综述总结了白细胞穿过ECM，尤其是基底膜向炎症部位浸润相关的生化和成像数据，以及慢性炎症（包括肿瘤部位）相关的ECM变化。本综述还讨论了如何依托上述信息来开发新型免疫疗法。

由于发现细胞微环境（主要由ECM决定）中转导的机械信号能够显著影响细胞迁移、增殖和分化等基本过程——而这些过程与炎症及肿瘤转移高度相关，因此ECM已引起了广泛关注。生物工程师和材料科学家正在探索如何利用这一信息来恢复组织功能，或作为将免疫疗法靶向特定部位的一种方式，这进一步拓宽了人们对ECM的兴趣，并引发了一系列问题：ECM或人工基质的力学特性或生物化学组成，在多大程度上可能影响这些方法的成功。事实上，先进的质谱技术已经产生了大量关于ECM及其相关调节分子（称为基质组）多样性的信息，表明即使在结构相似的基质中也存在广泛的生物化学多样性，因此，它们不仅有可能向细胞和组织传递多样化的机械信号，也有可能传递多样化的生物化学信息。

ECM以两种基本形式存在。其中更常见的是松散的纤维分子三维网络，称为间质基质，存在于大多数组织的间质中，它支持细胞粘附和/或迁移，并已广泛用于免疫细胞迁移的研究。相比之下，形成屏障的组织（如上皮和内皮）则形成基底膜（BMs）——一种二维片状ECM结构，能够限制细胞和溶质的移动，并增强相关细胞的屏障特性。BMs还定义了封闭的血管周围区域的边界，这在脑中尤为明显，髓系细胞和成纤维细胞群体长期驻留其中，而外渗的白细胞则短暂停留。此外，间质基质和BM分子的三维排列构成了淋巴器官的网状纤维，其不仅能分隔免疫细胞，还建立了一个管道系统，用于从外周炎症部位快速运输可溶性抗原和/或细胞因子。

ECM的超微结构由其生物化学组成决定，定义了其机械特性。此外，ECM的成分可向结合在其上或暂时穿行其中的细胞传递特定信息。ECM可通过ECM成分与免疫细胞受体——主要是β1整合素，但也可能是非整合素受体，如BCAM（也称CD239）和MCAM（也称CD146）直接结合；或间接通过呈递和/或释放结合的因子（如细胞因子）。关于ECM对免疫细胞行为的机械效应，已有若干近期综述进行了详细讨论；尽管ECM的生物化学与机械性质相互关联，但本综述聚焦于源自ECM的生物化学信号，特别关注BMs以及未被充分讨论的ECM新方面。

尽管ECM的组成在不同组织和生物体之间可能有所差异，但所有ECM都具备几个共同的关键特征，包括带有负电荷、能够自组装成复杂的超微结构，以及与细胞表面蛋白或细胞内蛋白相比较慢的更新速度。这些特性在ECM的功能中发挥着重要作用，尤其是在炎症背景下，如下所述。

ECM分子大致可分为糖蛋白或蛋白聚糖（蛋白聚糖是糖蛋白的一个亚类，带有大量的糖胺聚糖链）。它们是典型的大型多结构域蛋白，高度糖基化，并且通常也是硫酸化的。因此，它们带有高度负电荷，这解释了ECM结构的许多间接功能，包括结合和呈递细胞因子，以及排斥其他带电分子从而有助于形成屏障功能。

ECM最明确的特征在于其超微结构——二维片状的BM屏障、三维组织基质典型的“渔网状”组装体，以及淋巴器官网状纤维中这两种结构的组合（图1）。

这些不同ECM结构的组装需要细胞的参与，以及ECM成分的依次分泌和组装。BM的形成就是最好的例证；对早期小鼠发育、体外实验及果蝇的研究表明，分泌的层粘连蛋白与细胞表面受体（肌营养不良聚糖和β1整合素）的结合，对于其自组装和初始BM支架的形成至关重要。若缺乏这一步，IV型胶原的分泌和网络形成，以及随后的串珠素掺入BM过程都不会发生。类似地，纤维状胶原的组织需要成纤维细胞表面的细胞受体（α1β1、α2β1、α10β1和α11β1整合素）参与，在某些情况下还与纤连蛋白共同作用。此后，交联分子——包括纤维相关胶原和小分子量蛋白聚糖（如饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和光蛋白聚糖）——以及酶（如赖氨酰氧化酶、赖氨酰氧化酶样酶和转谷氨酰胺酶）调控胶原纤维组装成更粗的纤维及其相互之间的排列（图2），这决定了基质的硬度。网状纤维的复杂结构（由纤维状胶原核心构成，外层包裹着微纤维蛋白层，该蛋白层连接到一个类似BM的外层结构上，成纤维网状细胞附着于此）也提示蛋白质是按顺序分泌并自组装成这些层状结构的，尽管这方面尚未被广泛研究。这种需要细胞积极参与的ECM成分的分级分泌和有序组装引发了一个问题：在损伤和/或蛋白水解切割后（如白细胞穿越血管壁时发生的情况），ECM结构尤其是BMs是如何重建的。无法重建生理性ECM超微结构，或许可以解释为何在各种慢性病理状况的损伤后以纤维化占主导，而纤维化可能只能恢复部分而非全部组织功能。

先进的质谱方法结合ECM蛋白富集技术，用于表征不同组织的基质组，揭示了ECM的多样性及其组织特异性特征。

ECM分子在转录组水平上的研究尚不广泛；然而，目前已有多个组织的单细胞RNA测序数据可用，这些数据包含了编码ECM的基因信息。对这些数据的分析显示，与发育中的组织相比，成熟组织中编码核心ECM分子的转录本数量更低，这表明与细胞表面分子或细胞内结构分子（如肌动蛋白和中间丝）相比，ECM的更新速率较低。即使在炎症模型中，编码ECM的RNA水平变化也有限，主要与纤维状胶原及相关分子的异常表达相关，这些异常表达导致了此类疾病中典型的纤维化（图2）。

因此，尽管ECM常被描述为一种动态结构，但在非病理条件下，这种动态性并非源于组织蛋白质组的大规模改变，而是源于ECM组成的细微变化，以及其在受力变化时高度的伸展、变形和回弹能力，从而暴露出不同的细胞结合表位。考虑到炎症组织因细胞浸润和水肿而发生的体积变化，这种“动态”变化对于维持组织完整性至关重要，例如发炎的淋巴结因淋巴细胞涌入和增殖而发生的短暂肿胀就说明了这一点。这种淋巴结肿胀不需要ECM蛋白的从头合成，而是依赖于网状纤维的拉伸，以及结合在网状纤维外层BM样结构上的成纤维网状细胞在整合素和踝蛋白信号作用下发生的暂时性增殖。蛋白质组学和转录组学研究的联合数据，连同体内验证，表明ECM的长寿性、丰富性和生物物理特性构成了一种“组织记忆”——为长期驻留的干细胞或免疫细胞定义了微环境，并为损伤后的组织重建细胞提供引导线索——只有特定的分子会发生更新。

免疫细胞，特别是髓系细胞，在分泌影响ECM表达的分子（TGF-β、IFN-γ和TNF）或调节ECM结构（如基质金属蛋白酶、基质金属蛋白酶组织抑制剂及其他蛋白酶）方面，具有明确的作用。特别是，炎症因子会促进成纤维细胞异常表达纤维状胶原蛋白及其他间质基质分子（如腱生蛋白-C和纤连蛋白），导致组织力学特性改变及向相关细胞的信号传导异常。

然而，免疫细胞本身是否能分泌ECM分子仍存在争议。迄今为止，报道免疫细胞表达ECM的研究存在一个缺陷：缺乏与明确分泌ECM的非免疫细胞的比较。这些研究的一个更重要的局限性是，它们仅报道了异源三聚体ECM分子（例如，大多数胶原蛋白和所有层粘连蛋白）的单条链的表达，而这些分子的分泌需要至少两条、通常三条链的协调表达，并且在分泌前必须经过转录后和翻译后修饰。因此，免疫细胞中单个ECM转录本的转录不能被解释为蛋白质产生。

在脊椎动物组织中，尤其是髓系细胞与ECM结构以及通常与成纤维细胞（高水平产生多种ECM分子）的紧密关联，使得从组织中提取免疫细胞时，难以避免混入一些与之相关甚至被其吞噬的、产生ECM的非免疫细胞。这一点从那些旨在特异性分析髓系细胞群的研究中表达的非免疫细胞标志物（如Pdgfra、Pdgfrb、平滑肌肌动蛋白Acta1、上皮角蛋白Krt10和Krt15、心肌肌动蛋白Actc1、肌钙蛋白Tnn1和Tnn2）可以明显看出。因此，对分离细胞的批量转录组学和蛋白质组学分析可能会因为一个高水平表达ECM的细胞混入众多不表达的细胞中而产生偏差。大脑的数据（包括本文作者所在课题组未发表数据）表明，髓系细胞（或其他免疫细胞）很少或不表达核心ECM分子，但这些数据反而揭示了它们高表达ECM结合受体，如α6β1整合素以及αv、β3和β5整合素，这些受体可能对于它们定位在ECM微环境（如血管周围间隙）（见下文），以及可能对于它们的表型和/或激活状态是必需的。然而，不能排除在某些（病理）条件下，高度特化的免疫细胞亚群可能会表达核心ECM分子。为了阐明这一点，需要使用RiboTag转录组学（分析翻译中的mRNA）结合空间转录组学分析，将基因表达谱与细胞及原位相关的ECM蛋白质关联起来。

图1 稳态条件下ECM超微结构及其分子组成。

三种主要类型的细胞外基质（ECM）——基底膜、间质基质和网状纤维——及其核心组分和次要组分均已列出。

ECM在白细胞外渗中的作用

白细胞外渗在大多数组织中仅发生在毛细血管后微静脉，并且这一过程需要白细胞表达β1和β2整合素。毛细血管后微静脉的内皮细胞是血管系统中唯一表达白细胞在内皮上滚动（选择素）、黏附和爬行（ICAM1和VCAM1）所需黏附分子的部分，这些分子的表达受促炎细胞因子的诱导。

大量关于白细胞穿过BMs外渗的数据来自神经炎症背景下的大脑研究。在该背景下，由于脑血管具有独特的双层BM结构，因此容易确定白细胞外渗的位点；这种结构形成了一个封闭的血管周围腔室（图3），该腔室存在于整个脑血管系统中，包括较大的穿支小动脉和静脉，即使在非炎症状态下也是如此。

在神经炎症过程中，外渗的白细胞会短暂驻留在血管周围腔室中。此外，单细胞RNA测序研究揭示了血管周围腔室中存在常驻巨噬细胞以及成纤维细胞（图3）。长期驻留的巨噬细胞的功能是目前热门的研究方向；测序数据表明，它们具有高水平的吞噬活性和低水平的MHC II类分子表达，这表明它们具有“免疫沉默”的吞噬表型，与浸润单核细胞来源的巨噬细胞的促炎表型相反。血管周围驻留巨噬细胞对ECM结合整合素的高水平表达，可能在其定位及其静息表型中均发挥作用，这些课题需要进一步研究。

所有内皮BMs均含有IV型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（主要是串珠素）、巢蛋白和层粘连蛋白（图1）。层粘连蛋白α4和层粘连蛋白α5由内皮细胞和周细胞表达，层粘连蛋白α4在整个血管系统中普遍表达，而层粘连蛋白α5的表达则呈斑片状且水平较低，其表达始于毛细血管后微静脉和静脉水平。

多项研究表明，内皮BM的层粘连蛋白组成决定了白细胞外渗的优先位点。白细胞外渗仅发生在内皮BM中层粘连蛋白α5表达低或不表达的部位；在大脑中，由于白细胞在穿越两层BMs之间时会积聚在血管周围间隙，因此这一特点易于识别（图3）。对外周组织（在提睾肌模型的无菌性炎症中，以及在皮肤迟发型超敏反应模型中）的分析表明，外渗细胞（中性粒细胞、单核细胞或T细胞）同样会避开BM中层粘连蛋白α5高表达的区域。内皮BM中层粘连蛋白α5的表达与周细胞覆盖度（另一个影响外渗位点的因素）之间没有相关性，与其他BM分子（如netrin-1，其蛋白质序列与层粘连蛋白γ1同源，且受到炎症细胞因子和感染的下调）的表达也没有相关性。

BM层粘连蛋白调节内皮细胞连接

基因敲除小鼠的数据表明，内皮BM中的层粘连蛋白α5不仅对白细胞的分化和迁移有直接影响（见下一节），还对内皮屏障功能有间接影响。本文作者团队近期未发表数据提示，内皮细胞与BM中层粘连蛋白α5的相互作用，可能会促进内皮细胞表达某些白细胞黏附和爬行所需的分子，包括VCAM1和ICAM1。此外，黏附于层粘连蛋白α5能以整合素β1依赖性方式稳定内皮细胞间连接处的VE-钙黏蛋白；它还能抑制其他参与白细胞外渗的细胞连接分子（如CD99L2）的表达，并增加跨内皮电阻。这表明层粘连蛋白α5能够促进或维持内皮屏障的紧密性，尽管这些数据并未明确指出层粘连蛋白α5参与白细胞的血管内皮旁细胞迁移。

尽管VE-钙黏蛋白是内皮细胞间连接处主要的屏障定义分子，但其他连接分子（其中一些也表达于免疫细胞）也会影响白细胞的旁细胞迁移。研究表明，白细胞依次结合内皮细胞顶端接触处的ICAM1和JAM-A（也称为JAM1和F11R），随后结合CD99、PECAM1、CD99L2和ESAM1，这些过程参与旁细胞迁移。阻断PECAM1、CD99或CD99L2会导致白细胞被困在内皮基底面与下方BMs之间，提示与这些连接分子的相互作用可能为白细胞穿透BMs做好准备。

图2 胶原纤维生成与纤维化过程

BM层粘连蛋白直接调节白细胞

对提睾肌模型中渗出中性粒细胞和单核细胞的活体成像显示，虽然穿透内皮单层最多需要4分钟，但细胞会在内皮下方、内皮BM上迁移长达30分钟，直到找到层粘连蛋白α5表达较低的位置，然后穿过BM，这还需要额外的10分钟。尽管这些不同步骤所需的绝对时间往往因实验设置而异，但相对时间安排是相似的。例如，在神经炎症模型中穿过脑膜血管渗出的T细胞，其沿血管外表面迁移所花费的时间（30分钟）也远多于穿透内皮单层的时间（9分钟）。这些观察结果与早期电子显微镜研究的发现一致，那些研究经常发现白细胞位于内皮和BM之间。因此，数据表明，在内皮下方停留的时间是渗出过程中的一个限速步骤，并且对于启动免疫细胞随后穿透BM至关重要。

位于内皮和BM之间的渗出细胞会接收到几种信号，包括由顶端-基底侧与侧向限制差异产生的机械信号，以及生化信号。例如，限制作用可以影响巨噬细胞表达细胞因子。表面形貌是调节巨噬细胞（以及可能还有T细胞）活化和迁移的另一个因素。涉及致脑炎CD4+ T细胞的研究表明，它们向致病性且高迁移性的Th17表型的分化会受到与层粘连蛋白α5结合的抑制，但与其他层粘连蛋白亚型或纤连蛋白结合则不会。在一个关于组织驻留巨噬细胞被血源性单核细胞替换的肠道模型中，层粘连蛋白α5与内皮一起被证明可促进单核细胞向巨噬细胞分化，这与整合素谱的改变有关，这种改变使得正在分化但尚未终末分化的巨噬细胞能够优先迁移穿过层粘连蛋白511表达较低的位置。这些研究强调了内皮下位点（位于内皮的基底面和下方的BM之间）在调节免疫细胞表型和迁移能力方面具有关键作用，但它们也表明，在此位点转导的信号以不同方式影响不同的免疫细胞。

与间充质细胞相比，快速运动的变形虫样细胞（如白细胞）的蛋白水解能力有限，且黏附性较低。这类细胞如何穿透BM致密的ECM网络尚不清楚。超微结构研究表明，BM是由紧密交织的网络构成，其孔径为40–70 nm，覆盖总表面积的15%。这些孔隙太小，无法让免疫细胞通过，免疫细胞的直径范围从7–8 μm（淋巴细胞）到20 μm（单核细胞和树突状细胞），而细胞核的直径为3–5 μm。然而，这些孔隙可能是白细胞外渗的优选位点，通过外渗细胞产生的整合素依赖性力将其拉伸。目前尚不清楚这些孔隙是否与特定BM蛋白的表达相关。

研究细胞穿透BMs的一个主要问题是其分子复杂性，这在体外无法重现，例如使用基质胶。因此，最具生物学相关性的研究采用体内炎症模型，如实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型、提睾肌模型和迟发型超敏反应模型。尽管如此，可以在体外实验中使用单个BM成分（如层粘连蛋白和IV型胶原）来解析受体特异性和转导的胞内信号。然而，这类体外实验与体内情况相去甚远，在体内，单个BM成分对细胞结合的可及性可能有所不同，这取决于BM的拉伸程度以及外渗免疫细胞探查组织（如形成丝状伪足）的能力。更有前景的是使用无细胞的离体BMs（从小鼠组织分离的天然BMs）；目前仅能获得肠系膜BM，但未来可能会扩展到其他BMs和组织。

切除的肠系膜BM已被用于体外研究巨噬细胞和肿瘤细胞的迁移，结果显示，根据其活化状态，巨噬细胞可以采用非蛋白水解方式穿过肠系膜BM，或者通过MT1-MMP（也称为MMP14）进行蛋白水解降解，但不涉及丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶或其他MMPs。其他研究表明，非蛋白水解的迁移方式利用BM中预先存在的孔隙，这些孔隙被外渗细胞的探查过程（利用肌动球蛋白产生的力）扩大，在白细胞通过后，这些孔隙会回缩至正常大小。相比之下，在相同的实验中，癌细胞主要使用依赖MT1-MMP的蛋白水解方式穿透BM。虽然尚不清楚MT1-MMP在BM中切割什么物质，但这些研究表明，如果在巨噬细胞外渗过程中发生BM的蛋白水解切割，那也只是有限的，并且仅在特定的活化状态下发生。

使用不同物种和不同细胞类型的多项研究已经提出了细胞非蛋白水解方式穿透BMs的模式。此外，组织的免疫监视需要大量免疫细胞持续穿过内皮BMs，而不会对屏障的组成产生显著改变。在一个肿瘤模型中，肿瘤的BM定义了肿瘤细胞与基质细胞和成纤维细胞之间的边界，结果显示BM下方的成纤维细胞通过拉动、拉伸和软化BM来协助肿瘤细胞穿透BM。白细胞穿过血管BMs的外渗可能也有类似的模式，得到下方成纤维细胞甚至周细胞的帮助。这一过程取决于ECM的粘弹性特性，即ECM成分在物理应力或压力下相对移动的能力。例如，在某个焦点施加缓慢的压力可以导致ECM变形，从而产生细胞大小的孔隙，这些孔隙可以长时间甚至无限期维持，而无需蛋白水解修饰。这种ECM的缓慢变形与白细胞穿过BMs的迁移以及通过间质基质的迁移都相关（见下文）。由于需要施加力和肌动球蛋白系统的参与，白细胞整合素与胞外基质的结合是这种迁移所必需的。

图3 白细胞跨越毛细血管后微静脉外渗的关键步骤

目前缺乏直接的体内证据支持ECM的广泛蛋白水解切割在白细胞外渗过程中发挥重要作用。此外，这种广泛降解与已建立的ECM形成及更新机制不符，也与多种MMPs基因敲除小鼠未见炎症表型的事实相矛盾。然而，在CNS中，由于内皮与实质BMs在生化特性上存在差异，EAE模型中白细胞穿透实质边界的过程，与具有位点限制性的明胶酶（MMP2和MMP9）活性相关。骨髓嵌合体研究揭示，实质边界处的MMP2和MMP9既可来源于浸润性白细胞，也可来源于组织固有细胞。组织中MMP2和MMP9的表达依赖于较高的TNF/IFNγ比值，而这一比值由血管周围袖套中较高的TH17细胞与TH1细胞比例决定。

很少有其他模型能像EAE模型一样，如此精准定义明胶酶在炎症中的时空活性。然而，越来越多其他数据表明，MMP2和MMP9参与多种分子的选择性切割，包括趋化因子、细胞因子及其受体，提示这些MMPs的作用在于精细调控炎症，而非发挥广泛的降解功能。

整合素已被证实参与白细胞非蛋白酶解、依赖力的跨BMs迁移。早期研究表明，浸润中性粒细胞与血管内皮细胞之间由PECAM1介导的相互作用，可上调浸润中性粒细胞上α6β1整合素的表达（该过程依赖IL-1β，但不依赖TNF）。由于α6β1整合素是多种层粘连蛋白亚型的受体，这提示其可能促进随后的内皮BM迁移。事实上，在提睾肌模型中，阻断α6β1整合素可导致中性粒细胞浸润减少以及中性粒细胞被困在内皮与BM之间；在EAE模型中可抑制T细胞向脑内迁移；在提睾肌模型中可抑制单核细胞外渗。浸润白细胞与内皮之间的这些相互作用如何促进BM穿透，以及这种整合素上调发生在何处（例如，在内皮下微环境中），仍有待研究。

上文讨论的白细胞外渗的生理过程发生在组织稳态免疫监视和急性炎症状态下。然而，在慢性炎症中（如自身免疫性疾病和实体瘤周围的组织），组织会发生纤维化，这会影响浸润的免疫细胞和包括转移性肿瘤细胞在内的驻留细胞的行为。重要的是，在纤维化过程中，I型胶原原纤维之间的排列方式（由小分子量蛋白聚糖、原纤维相关胶原以及LOX和LOXL酶决定）控制着组织硬度。更硬的组织具有更厚的胶原纤维，且原纤维排列更趋向平行而非随机。因此，纤维化组织中不仅ECM的生化成分发生改变，其组装成三维结构的方式也发生了变化，这些因素共同影响传递给相关细胞的信号。

除纤维化外，持续性炎症还会进一步促进网状纤维和三级淋巴器官（TLOs）的形成。慢性炎症和肿瘤中还会激活血管生成过程，导致新生血管在BM特性上表现出未成熟血管的特征。

基质组分析显示，不同肿瘤类型ECM既有差异也存在共同变化。这些共同变化与慢性炎症组织中的变化相似，主要涉及间质基质分子（I型和III型胶原蛋白、纤连蛋白、腱生蛋白-C和血小板反应蛋白）、基质相关分子（如MMPs）以及交联分子（XII型胶原蛋白、双糖链蛋白聚糖和纤调蛋白）或交联酶（LOX和转谷氨酰胺酶）（图4a）。

由浸润和驻留的免疫细胞及基质细胞表达，或从ECM储存中释放的细胞因子（尤其是TGFβ）可激活纤维化中的基质成纤维细胞。多种细胞因子与间质基质中的蛋白聚糖、胶原蛋白或纤连蛋白结合，但TGFβ与纤维化特别相关，因为它既可以被从头表达，也可以从ECM内相当可观的储存中以潜伏形式释放。TGFβ能强烈诱导活化成纤维细胞表达纤维状胶原蛋白、纤连蛋白、腱生蛋白-C和TIMPs等蛋白酶抑制剂，促进巨噬细胞向促炎表型分化，并可能促进内皮细胞和血管周围细胞去分化。

巨噬细胞在纤维化中也发挥重要作用。肺和肝脏研究显示，在纤维化起始阶段清除巨噬细胞具有保护作用，而在纤维化进展过程中清除巨噬细胞则会加剧纤维化。这些效应主要通过巨噬细胞上的集落刺激因子1（CSF1）受体信号传导介导。巨噬细胞高表达ECM受体和Toll样受体（TLR），后者可被各种ECM片段（如腱生蛋白-C）激活。巨噬细胞与成纤维细胞（ECM和巨噬细胞生长所需CSF1的主要生产者）也密切相关。

TLOs通常在持续炎症状态下在组织中形成。其基本结构——包含被网状纤维网络分隔的B细胞区和T细胞区，以及存在抗原呈递细胞、巨噬细胞和高内皮微静脉（HEV）样血管（图4b）——与次级淋巴器官（淋巴结和脾脏）相似。然而，也存在差异，包括TLOs缺乏周围的纤维包膜，这有助于其与周围组织的连接。有趣的是，次级淋巴器官和炎症组织中的TLOs的HEVs具有显著的BM，其在生化特性上不同于其他毛细血管后微静脉；HEVs低表达层粘连蛋白α4但高表达层粘连蛋白α5，然而它们支持白细胞快速外渗。

目前关于次级淋巴器官和TLOs的大部分结构和功能数据来自对自身免疫性疾病的研究。这些TLOs中的网状纤维作为重要的结构支撑，并构成一个封闭管道，用于将抗原和其他可溶性因子（如细胞因子）快速递送至HEVs，以招募循环T细胞。此外，树突状细胞与网状纤维的BM层结合，并可以对其内容物进行取样，以便快速将抗原呈递给周围的T细胞。

目前尚不清楚肿瘤中形成的TLOs是否在抗原呈递、免疫细胞招募和成熟方面具有相同功能。然而，在实体肿瘤中，存在具有B细胞和T细胞有序区室化结构的TLOs，与更好的预后和免疫治疗中更好的临床结局相关。此外，与肿瘤外周位置或邻近间质中的定位相比，TLO位于肿瘤内部可改善临床结局。总之，TLOs是在自身免疫性疾病和免疫活性实体肿瘤中，由浸润白细胞激活基质细胞而响应的、改变的ECM的一部分。

图4 实体瘤中ECM的变化

尽管炎症和肿瘤都会诱导新生血管形成，但此处重点讨论肿瘤血管。肿瘤血管在形态上具有多个特征，提示其呈现未成熟表型，包括血管不连续、扭曲度增加，这是由于内皮细胞和血管周围细胞发生改变，同时间质基质增多且BM结构改变所致（图4c）。肿瘤内因灌注不良和ECM扩张而导致的缺氧、坏死和高间质静水压，不仅阻碍化疗药物的有效递送，还会影响肿瘤相关细胞（内皮细胞、成纤维细胞和TAMs）的功能。

靶向ECM以改善免疫疗法

目前正在研究的几种基于ECM的辅助疗法，旨在提高免疫疗法的疗效，包括：（1）减少纤维状胶原的交联并破坏其三维结构；（2）将促炎性细胞因子靶向递送至肿瘤ECM；（3）引导CAR-T细胞到达肿瘤部位；（4）利用生物工程基质促进TLO的形成（图5）。这些基于ECM的疗法仍处于早期开发阶段，其成功通常依赖于有效的肿瘤递送方式。因此，通常还需要能够使肿瘤血管正常化的疗法。

LOX和LOXL酶、小分子量蛋白聚糖以及纤维相关胶原蛋白，是I型和III型胶原纤维交联所必需的，并决定了它们的三维结构和组织硬度。其中，靶向LOX和LOXL酶作为抗纤维化治疗策略被研究得最为广泛。在小鼠癌症模型中，通过遗传学方法抑制LOX和LOXL的表达，可减少转移并改善对化疗的反应。然而，通过化学或抗体介导的方式抑制LOX或LOXL2的活性，虽然在体外非常有效，但要么具有较高的毒性而无法在临床上使用，要么在针对癌症或纤维化疾病患者的临床试验中获益有限。

抑制纤维状胶原蛋白交联的另一种替代方法是使用蛋白酶来增加其降解。对小鼠和患者样本的纤维化组织进行的RNA-seq分析显示，几种蛋白酶的表达上调，特别是MMP2和MMP9，还包括ADAM家族（去整合素和金属蛋白酶）及带有血栓软骨素基序的ADAMs（ADAMTS）家族成员。由于越来越多的证据表明，ECM分子仅占MMP底物的一小部分，其底物还包括趋化因子及其受体、ECM受体、细胞因子和生长因子等，因此使用MMP抑制剂来抑制纤维化可能会产生多种脱靶效应，包括释放与ECM结合的TGFβ、消除或诱导趋化信号，以及释放基质蛋白片段。MMP抑制剂已被广泛开发并用于测试自身免疫性疾病和肿瘤，但很少取得显著疗效，且伴有多种副作用。一个主要问题是这类抑制剂的特异性低；人类体内有24种MMPs，它们具有不同的底物，但活性位点均含有Zn2+，这也是化学抑制剂的主要靶点。尽管正在开发更具特异性的MMP抑制剂，但由于MMPs的作用广泛，此类抑制剂在纤维化疾病和肿瘤纤维化中往往同时产生正面和负面效应。

图5 利用或抑制肿瘤纤维化的辅助癌症疗法的发展

靶向ECM的促炎性细胞因子

肿瘤内部或周围丰富的ECM分子及其低周转率已被用于将抗肿瘤疗法靶向递送至肿瘤内部并提高其疗效。免疫检查点抑制剂（如抗CTLA4、抗PD1和抗抗PD-L1抗体）本身并不诱导免疫反应，而是增强局部的抗肿瘤免疫反应。因此，其疗效取决于肿瘤内已有的免疫反应。将此类免疫疗法与靶向肿瘤ECM、能诱导免疫反应和/或促进持续免疫反应的细胞因子相结合，可能是有益的。

IL-2和IL-12可诱导T细胞和自然杀伤细胞的增殖与活化，从而介导抗肿瘤免疫，它们已被作为此类辅助免疫疗法进行研究。然而，高剂量下的全身毒性限制了它们的系统性应用，而直接注射到肿瘤内时，它们又会迅速弥散到周围组织和循环系统中。将IL-2或IL-12与胶原蛋白结合蛋白（如小型蛋白聚糖基膜聚糖）连接成融合蛋白，进行瘤内注射，可将细胞因子滞留在肿瘤内，从而降低全身毒性并促进局部炎症。在小鼠肿瘤模型中，将这些融合蛋白与免疫检查点抑制剂共同进行瘤内注射，可提高检查点免疫疗法的疗效。有趣的是，这些研究还显示，瘤内注射基膜聚糖-细胞因子融合蛋白对未注射的对侧肿瘤也有系统性效应，这表明激发局部免疫反应可产生积极的系统性效应，从而可能限制转移。

使用对肿瘤特异性ECM分子（如纤连蛋白的EIIIB结构域，也称为EDB；或癌胚型腱生蛋白-C结构域）具有高特异性和高亲和力的纳米抗体与细胞因子融合，可进一步增强此类辅助疗法的肿瘤靶向性和肿瘤滞留特性。然而，上述所有靶向ECM的策略都需要直接注射到肿瘤内。为了向可静脉注射的辅助免疫疗法迈进，研究者将血管性血友病因子的胶原蛋白（I型和III型）结合结构域通过化学连接与免疫检查点抑制剂抗体结合，或将其作为重组蛋白与IL-12融合，这两种方法在多种小鼠癌症模型中均能抑制肿瘤生长且无全身毒性，且两种方法的联合具有叠加效应。除胶原蛋白结合蛋白外，肝素结合结构域以及结合癌胚型腱生蛋白-C和血小板反应蛋白-1的结构域也已成功用于此类靶向策略。尤其值得注意的是，癌胚型腱生蛋白-C在多种实体瘤中高度上调，其为将化疗、放疗和免疫疗法靶向递送至肿瘤提供了多个有前景的选择。

将CAR T细胞导向肿瘤

在一种更直接的方法中，研究人员正尝试靶向肿瘤ECM，以递送携带特异性识别肿瘤抗原的CAR T细胞。CAR T细胞疗法在治疗B细胞恶性肿瘤方面尤为成功，但在实体瘤中效果较差；部分原因是许多实体瘤缺乏特异的分子靶点，同时也因为纤维化屏障和血管异常导致CAR T细胞难以有效递送到实体瘤中。表达肝素酶等ECM降解酶的肿瘤抗原特异性CAR T细胞，在动物模型中表现出更好的肿瘤浸润能力，与不表达肝素酶的CAR T细胞相比，能够延长宿主的生存期。

促进肿瘤内炎症反应的一种创新方法是在肿瘤内诱导TLOs的形成。将含有靶向肿瘤中高表达蛋白（如腱生蛋白-C）的分子、以及能够促进TLO形成的因子如淋巴毒素（LT）样分子的纳米颗粒注射到肿瘤内，可促进TLO的发育。类似地，使用含有缓慢释放水凝胶珠的胶原支架，这些水凝胶珠负载有LTα1β2以及招募淋巴细胞所需的细胞因子（如CCL19、CCL21、CXCL12、CXCL13和RANK配体），当将其注射到小鼠肾被膜下时，也能形成类TLO。类似的水凝胶方法已被用于在肿瘤内递送STING激动剂，以激活局部先天免疫反应，表达CXCL13、CCL19和CCL21等趋化因子，从而形成TLO并抑制肿瘤生长。此外，还可以在体外构建合成支架（例如用纤维状胶原蛋白（I型）和/或Matrigel功能化的聚氨酯或聚乙二醇支架），并与成纤维网状细胞共同培养，生成用于体内转移的合成支架；这些支架通过提供所需的空间并释放包封的细胞或细胞因子，也能诱导TLO的形成。尽管这些方法尚处于初步开发阶段，但它们作为辅助疗法，有望促进肿瘤局部炎症反应，同时也能促进CAR T细胞向肿瘤内的募集。

ECM在炎症过程中仍是一个被忽视的组成部分，然而它在所有组织中含量丰富，传递重要的生物学信息，并且免疫细胞在免疫监视以及到达感染或损伤部位的过程中必须穿越细胞外基质。此外，ECM是淋巴器官（包括TLOs）的组成部分，TLOs对于局部免疫反应的快速有效传播至关重要。关于不同组织和条件下的ECM，转录组学和蛋白质组学数据日益增多。挑战在于，要将这些海量信息不仅与体内细胞和ECM结构相关联，还要与生物化学和蛋白质结构数据联系起来。这需要结合高维空间蛋白质组学、转录组学，以及在特定时间点对特定组织和结构进行RiboTag转录组分析。此类研究对于定义组织的稳态条件，进而确定急性炎症、慢性炎症和肿瘤周围炎症等不同病理条件下ECM发生的特定时空变化至关重要。这样全面的分析将有助于识别特定条件下独特且可能非常细微的ECM变化，判断这些变化是否以及如何影响ECM的三维结构，从而影响所暴露的表位——这些表位可用于开发针对性的促炎辅助疗法，并将其应用于肿瘤免疫治疗。

Lydia Sorokin, Nature Reviews Immunology 26, 350–366 (2026): Biochemical signals from the extracellular matrix in inflammation and tumour immunology.