mRNA脂质递送载体LNP的处方分析（可电离脂质）

脂质纳米粒(LNP)是一种具有均匀脂质核心的脂质囊泡，广泛用于小分子和核酸药物的递送，最近因其作为COVID-19mRNA疫苗递送平台的巨大成功而备受关注。由mRNA诱导的瞬时蛋白表达的应用远不止传染病疫苗，在癌症疫苗、蛋白质替代疗法和罕见遗传病的基因编辑组件等也具有巨大的潜在应用价值。然而，裸露的mRNA本身极不稳定，易被核酸酶和自水解而快速降解。LNP的封装可以保护mRNA不受细胞外RNA酶的影响，并协助mRNA的胞内递送。

近年来，脂质纳米粒(LNP)已成功作为RNA疫苗和疗法的递送平台。裸露的RNA是一种带负电荷的亲水性大分子，由于细胞膜的静电排斥，难以进入细胞，且易被体内RNA酶迅速降解。因此，需要保护性外壳才能进入细胞。因为细胞膜主要由脂质组成，利用脂质囊泡包封RNA可通过细胞膜并将RNA释放到细胞质中。因此，囊泡首先应该是一种带正电的脂质，能够结合带负电的RNA。然而，由永久性阳离子脂质组成的囊泡由于能与带负电的细胞膜发生静电作用而引起细胞毒性，脂质结构已经发展成为能够对内体酸性环境响应而带正电荷的分子。

LNP的制备取决于自组装能力，即脂质成分发生分子间相互作用而自发组织成纳米结构实体。首先，带负电荷的核酸和带正电荷的脂质之间通过静电结合，然后，通过脂质组分之间的疏水作用和范德华作用进行组装，进而形成LNP。由于脂质化学的多样性、核酸的独特性以及两者混合的时间特性，自组装早期阶段的表征和对LNP最终性质相关影响的研究依然具有挑战性。LNP制备方案至少会在两方面影响自组装产物：LNP的均匀性和核酸负载效率。

LNP制备方法最常用的方法是水相和脂质成分快速混合的微流控法，其具有良好的重复性，但是对于中试生产而言，微流控通量小。采用冲击式射流混合设备，具有通量大，没有一次性耗材等特点，适合大规模生产。

阳离子脂质(CLs)和可电离脂质(ILs)

阳离子脂质(CLs)和可电离脂质(ILs)可通过静电相互作用启动自组装的第一步。含有阳离子脂质的脂质复合物仍然广泛用于核酸递送。然而，由于毒性问题和缺乏体内效力，已基本被pH响应性可电离脂质所取代。LNP配方中，生理pH下可电离脂质表现为中性，而在内体的酸性环境中则带正电荷。由于有效性和毒性特征的大程度改善，pH依赖性的电离能力使可电离脂质成为核酸递送的合适材料。可电离脂质在配方中的占比通常为总脂质的20%−40%。目前，许多研究致力于微调可电离脂质的性质以进一步提高效率，尤其在难以到达的人体组织中递送效率的提高。阳离子脂质和可电离脂质的整体结构可分为三个部分：(1)头部、(2)连接片段、(3)尾部。

头部

可电离脂质的头部基团通常带有正电荷。头部基团的大小和电荷密度主要参与包裹核酸，稳定LNP，与细胞膜相互作用及促进内体逃逸等过程。常见的可电离脂质仅包含一个头部基团、有时也包含几个头部基团。典型的头部基团包括胺(伯胺、仲胺、叔胺、季胺)、胍、杂环基团等。临床上使用的可电离脂质(DLin-MC3-DMA, SM-102, ALC-0315)包含叔胺头部、可发生pH依赖性的离子化。ALC-0315和 SM-102的头部基团还含有一个末端羟基，可以减少头部基团的水化作用，提高与核酸的氢键相互作用，从而可能提高转染能力。

连接片段

连接片段可以将头部与尾部连接起来，有时连接片段也会隐藏在尾部内(SM-102、ALC-0315)。连接片段会影响LNP的稳定性、生物降解性、细胞毒性和转染效率。常见的连接片段如图所示。可电离脂质可能包含一个或多个连接片段；而大多数可电离脂质只包含一种类型的连接片段，原因可能是容易合成。连接片段可分为不可生物降解(如醚类和氨基甲酸酯类)和可生物降解(如酯类、酰胺类和硫醇类)两类。生物可降解连接片段是首选，因为通常可在体内快速清除，可多次剂量使用和减少副作用。DLin-MC3-DMA、ALC-0315和SM-102都含有酯键连接片段。其中SM-102的酯基周围的修饰会影响LNP的清除、配方稳定性和转染效率。

尾部

疏水性尾部会影响pKa，亲脂性，流动性和融合性，从而影响LNP的形成和效力。可电离脂质通常含有1~4条疏水尾部，其中包含8~20个碳原子。尾部可以是饱和/或不饱和的脂肪链（图2），其不饱和程度可通过调节膜不稳定的相关性质影响核酸递送。DLin-MC3-DMA有两条亚油基尾部，而ALC0315和SM-102则有两条分支饱和尾部，被认为具有锥形几何形状，促进内体膜不稳定性和核酸的胞质内释放。

可电离脂质性质

可电离脂质可当作是一种多组分分子，其中每一部分都必须精确设计，以安全有效地包装和递送核酸。了解可电离脂质的整体特性也有助于下一代可电离脂质的开发和设计。其中计算pKa(cpKa)是主要参数之一，可以通过计算机容易获得。可电离脂质的cpKa通常为9-10.5。最近研究表明，cpKa与实际pKa非常接近。可电离脂质的cpKa可影响相应LNP配方的整体pKa，当可电离脂质的cpKa约为8.5~10.5时，LNP的pKa大约为6~7。可电离脂质的cpKa和LNP的pKa之间的差值似乎是一致的，约为2−4个单位。因此，cpKa可用于指导新型可电离脂质的设计。总之，可电离脂质的各部分性质能够影响LNP的整体配方和生物学特性。在过去的50年里，大量的系统性研究致力于设计理想的可电离脂质。其中一些可电离脂质已被FDA批准用于基因货物的递送。然而，还需要大量的研究设计能够高效递送不同类型基因货物的无毒非肝靶向可电离脂质。

LNPs组成成分

LNP四大组成成分相对固定：胆固醇、磷脂、PEG衍生物、阳离子脂质。其中阳离子脂质是灵魂，兼具充分包裹mRNA分子和促进细胞吸收两重作用，是LNP逃离内体的关键成分。阳离子脂质与带负电的 mRNA 结合，可高效包载核酸药物，同时提供正电荷，与带负电荷的mRNA复合，有助于内涵体逃逸。常用的产品有DLin-MC3-DMA，DOTAP.Cl，DC-CHOL等。而聚乙二醇化磷脂可提高粒子稳定性，减少粒子在体内与血浆蛋白的结合，延长体循环时间。例如DMG-PEG2000，DSPE-MPEG2000。新冠疫苗中， Moderna和 BioNTech基本成分一样，阳离子脂质（Moderna）与聚乙二醇脂质（BioNTech）结构极其相似，各组分比例近似，它们用到的脂质体还包括ALC-0159，cholesterol，ALC-0315，DSPS，SM-102等，如表1。

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表1：mRNA新冠疫苗中LNP的组成

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