年度综述：CAR NK 细胞：未来已来

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在CD19阳性的B细胞血液瘤领域取得了巨大成功，成为划时代的新型疗法。自然杀伤(NK) CAR细胞提供了CAR T细胞的替代方案，具有成为通用型现货细胞疗法的潜力。细胞类型的选择和CAR的选择都与细胞疗法的可行性、有效性、持久性、副作用和安全性相关。到目前为止，CAR NK细胞疗法的研发仍具有很大的难度和挑战性。本文发表于《ANNUAL REVIEW OF CANCER BIOLOGY》，由德国柏林夏里特大学的Martin J. Raftery, Alexander Sebastian Franzén和 Gabriele Pecher撰写，概述了CAR NK细胞的来源、基因修饰手段以及用于临床的CAR NK细胞的制造和质控，并讨论改进的手段及未来需要解决的问题。

自然杀伤 (NK) 细胞大约在50年前首次被人们认识，这是一种存在于外周循环中的先天性淋巴细胞。它们由淋巴祖细胞发育而来，其特征是表达转录因子 EOMES和T-bet。NK 细胞对IL-12、IL-15和IL-18 特别敏感。与T或B细胞不同，NK细胞的激活是由体细胞编码的激动性和拮抗性先天分子控制的，而不是由依赖重组的重排多态抗原受体控制的。然而，NK细胞的细胞毒性机制与CD8+T细胞相似，都通过死亡配体和脱颗粒作用来杀死靶细胞。

人体中控制NK细胞的受体可分为两个功能组：激活型和抑制型。激活分子包括天然细胞毒性受体、NKG2D、某些CD94/NKG2复合物和CD16 (FcγRIII)。激活分子识别细胞上除CD16之外的伙伴配体，CD16是一种低亲和力Fc受体，负责抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。抑制分子包括杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)分子家族、一些CD94/NKG2复合物和白细胞Ig样受体 (LIR)。当激活配体与抑制配体的比例发生有利于激活的变化时，NK细胞就会被释放到血液循环中，随时准备被疾病环境的变化激活。共刺激和共抑制分子在T细胞中组成了类似的免疫检查点系统。

由于外周终末分化的NK细胞普遍缺乏克隆扩增，因此骨髓中的未成熟NK细胞通过颗粒效应细胞不断产生终末分化的NK细胞。在外周，NK细胞通常根据 CD56表达水平分为两个亚群。CD56强NK细胞产生更多细胞因子，具有高度增殖性，并且被认为是CD56弱NK细胞的前体。CD56弱NK细胞具有高度细胞毒性并表达CD16，这使得它们能够通过ADCC攻击靶细胞。单细胞转录组分析进一步阐明了这一过程，包括骨髓中祖细胞NK(NK0)的存在并且外周循环中的NK细胞亚群也更加复杂，已识别出七组，包括终末分化和记忆样NK 细胞。

一段时间以来，人们已经知道T细胞是导致患者移植物抗宿主病(GvHD)的原因。有大量文献表明NK细胞不会引起GvHD或其他副作用，如神经毒性或细胞因子释放综合征(CRS)。因为这些特性，NK细胞被认为更适合用于开发通用型细胞治疗平台。

NK细胞已被证明可以有效抑制某些形式的血液癌症，尤其在预防转移方面表现出卓越的效果。目前的NK疗法旨在克服TME，可通过基因修饰的方式使NK细胞更好地靶向实体瘤及其微环境。在进行异体移植时，NK细胞可能会导致宿主免疫系统的部分或全部清除。已有临床试验表明，自体移植NK细胞疗法对黑色素瘤、肾细胞癌和胃肠癌无效，这表明异体移植可能是NK疗法更好的应用场景。因此，STING信号通路的活化可能对该疗法有加强作用。

自Kuwana等人（1987 年）和Gross等人（1989 年）首次提出CAR概念以来，CAR细胞疗法已成为生物医学的成功典范，并已应用于临床治疗黑色素瘤和CD19表达的血液瘤。CAR分子本质上重新利用信号分子，将细胞毒性转向能结合抗体的靶细胞。在这一场景中，核心是靶向细胞的重定位，而效应细胞功能通常维持不变。尽管抗体经常被用作识别元件，但其他分子如TCR、NKG2D或ACE2也被使用。当前的趋势是在CAR结构中包含更多元素，将功能从细胞转移到结构上。另一种策略是在根据已有的研究预先构建好具备理想表型的效应细胞（T或NK），然后直接转入CAR结构，从而简化CMC过程。这一过程的完善能让我们在短时间内从实验室进入临床，也是通往终极细胞疗法的必经之路。

第一代CAR将CD3信号结构域与受体分子（通常来自抗体）结合在一起，而现在CAR已经发生了很大的演变。目前的下一代CAR保留了识别和信号结构域，但也可以根据需要释放细胞因子、趋化因子受体、检查点抑制剂、自杀基因、双重抗原、共刺激结构域和逻辑门CAR。事实证明，CAR 的应用极为灵活和多元化。

2.1.CAR优化：细胞因子、趋化因子和趋化因子受体

IL-15表达已被证明对NK的扩增和激活非常重要。来自CAR载体的IL-15或 IL-15超级激动剂的组成型或诱导型表达足以允许NK CAR细胞在体内扩增。同样，去除IL-15负调节因子会促进扩增，滋养细胞表达IL-15也会促进扩增。最后，在急性淋巴细胞白血病（ALL）和急性髓系白血病 (AML) 的动物模型中，发现载体编码的IL-15是提高荷瘤动物生存率所必需的。此外，临床前研究表明，趋化因子受体CXCR1和CXCR4的表达可帮助CAR NK细胞克服 TME的限制。

2.2.CAR优化：共刺激和信号传导域

对NK特异性分子DAP10、FcεR1γ、CD3ζ  2B4 和 4-1BB 的信号传导和共刺激结构域的比较研究发现，在NK细胞中，最佳组合是2B4与CD3ζ 及4-1BB与CD3ζ 。由于具有CD28共刺激域 CAR NK细胞在临床中已被证明非常有效，因此看到这些新CAR组合的效果将会很有趣。尽管CD28共刺激结构域在CAR NK细胞中发挥作用，但NK细胞本身并不表达CD28。当CAR结构中的CD28被替换为其同源物CD28H时，NK细胞表现出更强大的抗肿瘤活性。NK细胞较短的生命周期是目前限制其长期疗效的最大因素。

2.3.CAR优化：Fc 结合蛋白

CD16是NK细胞的决定性分子，参与NK细胞抗体依赖的毒性攻击（ADCC）过程。因此，人们对将Fc受体整合到CAR中产生了极大的兴趣，尤其是因为这可以增强治疗性抗体的治疗效果。例如，在NK细胞系NK-92上表达 CD16a/FcεRI 嵌合体，并联合HER2单克隆曲妥珠单抗疗法，导致针对 HER2+靶标的ADCC。嵌合CD16分子已在CD16阴性NK细胞系和T细胞上进行了广泛测试，NK细胞通常表达CD16。不过，目前在CAR NK细胞中加入原生CD16或衍生分子是一种非常有效的策略，可结合抗体疗法将ADCC重定向到相应靶点。

尽管T细胞和NK细胞都具有细胞毒性，但在细胞疗法的开发方面，NK细胞比T细胞具有优势。NK细胞无需事先致敏即可杀死肿瘤，而T细胞则需要针对肿瘤进行扩增才能识别和杀死肿瘤。这是因为NK细胞的抗原识别系统是基于对大部分细胞上存在的多个重叠的不变应激分子的检测，因此临床上单独使用的NK细胞具有先天的抗肿瘤能力。该作用独立于CAR等外源识别分子，并且与实体瘤中癌症发病率和预后相关。当CAR存在时，两个系统可以协同工作来识别和破坏肿瘤细胞。然而因为NK细胞普遍缺乏克隆扩增，其在体内的持续功能存疑，导致使用T细胞的CAR研究目前占主导地位。

图1 CAR NK细胞和CAR T细胞疗法的开发时间表。缩写：CLL，慢性淋巴细胞白血病；FDA，美国食品和药物管理局。

在细胞疗法的开发中，T细胞比NK细胞更受青睐，这可能更多是实际应用的结果，而不是理论上的考虑。其中有多重的原因。NK细胞在体内的寿命与中性粒细胞相当，只有1-2周，且难以扩展。原代 NK细胞的扩增需要比T细胞更具挑战性的方案，目前的方案都需要滋养层细胞的参与，增加了操作的复杂性和成本。

原则上，细胞疗法是通过招募和激活宿主内源性免疫系统来对抗肿瘤。研究观察到CAR细胞疗法招募内源性免疫细胞进入TME中的能力较弱。然而来自诱导多能干细胞 (iPSC) 的CAR NK细胞可以招募CD8+T细胞来协同对抗肿瘤，可能是未来NK疗法的发展方向。

3.1.CAR NK细胞的来源

许多CAR NK细胞的初步研究都利用了NK细胞系，例如YT和NK-92，因为它们具有卓越的稳健性和增殖能力，研究结果令人鼓舞，足以将它们转入临床试验。NK细胞系因为易于扩增而大受欢迎。然而，NK细胞系源自淋巴瘤，必须经过辐射或以其他方式灭活。这就防止了细胞在体内的长期存活，而这一特征与治疗效果显著相关。此外，没有一种细胞系是完全正常的，所有细胞系都有很大的局限性。

表1 大量扩增CAR NK细胞的NK制造策略总结

正在出现的一个特别思路是使用记忆类或经训练的NK细胞。记忆NK细胞最早是在病毒感染的背景下被描述的。巨细胞病毒感染会导致具有增强细胞毒性能力的记忆型NK细胞亚群扩增。细胞因子暴露也能诱导记忆NK细胞，这也会增强它们对AML的抗肿瘤活性。CAR记忆NK细胞是CAR NK细胞疗法的一个有前途的发展方向。

3.3.CAR NK细胞的制造

CAR NK细胞的临床应用需要足够强大的扩增和生产方法，以扩增相当数量的高度确定的细胞，从而生产出先进的治疗药物产品。

3.3.1.基因转移方法

通过逆转录病毒和慢病毒载体系统将CAR构建体引入NK细胞是有效的并且可以进一步优化的方案。通过将慢病毒载体包膜伪型从VSV-G更改为源自非人灵长类逆转录病毒的蛋白质，可以提高NK细胞的转导效率。据报道，这种策略允许优先转导增殖性NK细胞，从而有利CAR NK细胞的扩增。还报道了另一种策略，即通过TBK1暂时阻断先天免疫途径，使原代NK细胞更容易受到 VSV-G伪型慢病毒载体的转染。

3.3.2. CAR NK细胞扩增用于临床应用

细胞疗法需要大量按照良好生产规范（GMP）生产的细胞才能达到治疗剂量。最近的一项CAR NK细胞试验使用的剂量范围为每位患者10^8 –10^10 个细胞。过去，NK细胞很难生产出如此数量的细胞。用于扩增临床级NK细胞的策略包括基于滋养细胞的系统，以及专注于细胞因子、磁珠、磁珠聚合物和质膜衍生颗粒的无滋养细胞系统。

目前，滋养细胞培养系统是实现临床相关NK细胞剂量的最有效系统。滋养细胞培养系统使用表达低内源性表面MHC I类的永生化细胞系，并转导了膜结合 (mb) 刺激分子如mbIL-15、mbIL-21和4-1BBL。不同滋养细胞类型（K562 和LCL721.221）之间的比较表明，滋养细胞上不同NK受体的表达会导致NK功能的改变，说明了选择滋养细胞的重要性。然而，永生化细胞系对临床应用构成安全风险，因此，它们的使用会带来更大的监管负担和安全测试成本。

由于滋养细胞存在潜在风险，研究人员一直在开发用于NK细胞扩增的无滋养细胞解决方案。NK细胞可以使用高剂量的刺激性细胞因子、刺激分子包被的磁珠 、涂有刺激性抗体的聚合物微球或质膜衍生颗粒进行扩增。然而，迄今为止，无滋养细胞系统尚未能够超越滋养细胞所实现的高扩增率。

NK细胞培养中的两个重要考虑因素是培养基和细胞因子的选择（表1）。此外，临床使用时通常需要在培养基中添加人AB血清，特别是考虑到胎牛血清引起的异种致敏和非特异性炎症。血清限定或无血清补充剂目前正在进入市场，其性能与人AB血清相似。

为了制造临床级NK细胞，需要在GMP条件下执行NK扩增方案，这可以在 GMP认证的实验室中手动执行，也可以使用自动化生物反应器执行。自动化生物反应器可以通过维持完全封闭的系统来保证无菌，从而最大限度地减少潜在的微生物或交叉污染。所有上述策略都可以组合成自动化生物反应器系统，从而降低生产成本、提高效率并最大限度地提高安全性。