Nature综述：体内工程化CAR-T的应用前景

嵌合抗原受体（CAR）工程免疫细胞疗法是癌症治疗的重要突破，但复杂的体外制备流程和严格的患者筛选限制了其广泛应用。体内CAR工程具有简化生产、降低成本等优势，正成为一种有前途的现成疗法。临床前研究推动了其在实体瘤等难治疾病中的应用，并促进了高效、持久且安全的递送系统开发。本文综述了当前的体内CAR工程策略，通过与传统体外CAR工程技术的对比分析，深入探讨了体内CAR工程在临床应用中的关键挑战，并对其未来发展前景进行了展望。

CAR-T细胞疗法作为癌症免疫治疗的重大进展，已有7款FDA批准产品成功用于治疗多种血液肿瘤。但现有疗法均需自体T细胞体外改造，涉及复杂个性化制备流程和高昂成本，限制了其广泛应用。为解决自体CAR-T的制造瓶颈，"现货型"异体CAR-T产品展现出显著优势：即用性强、成本低且可标准化生产。然而，异体CAR-T细胞存在引发致命性移植物抗宿主病（GvHD）的风险，仍需进行淋巴细胞清除以预防宿主免疫排斥。因此，亟需开发兼顾疗效与成本的新型CAR-T细胞工程技术。体内CAR-T细胞疗法可突破现有体外制备的自体和异体CAR-T细胞疗法的技术瓶颈：1）作为现货型疗法，可简化生产流程、降低成本；2）非整合载体设计可规避T细胞耗竭等安全问题；3）技术平台已延伸至NK细胞等免疫细胞研究。

图1. 自体和异体CAR-T细胞体外治疗与体内CAR-T细胞治疗的比较概述

3 体内CAR-T细胞工程策略

当前临床前研究探索了多种体内CAR-T生成技术，主要包括：负载mRNA的脂质纳米颗粒（LNP-mRNA）、封装核酸的聚合物纳米颗粒、病毒载体（慢病毒/AAV）、生物支架及新型载体（Cas9-EDVs/FuNVs）。各平台在靶向性、系统风险和基因整合安全性上各具特点，其中LNP-mRNA技术凭借疫苗成功经验，显示出短暂但有效的CAR表达潜力。

3.1 LNP-设计的核酸

LNP-mRNA技术作为经COVID-19疫苗验证的成熟平台，在体内CAR-T细胞工程中展现出独特优势：其瞬时表达特性（不整合基因组）可降低毒性且无需注射前淋巴细胞清除，通过CD3/CD8等靶向抗体修饰可定向递送至淋巴组织，显著提升T细胞转染效率。临床前研究表明，CD3靶向LNP系统在脾脏T细胞中实现剂量依赖性CAR表达，并维持90天以上的持续抗肿瘤效果，同时靶向IL-6 shRNA的共递送可降低细胞因子释放综合征（CRS）风险。但该技术仍面临靶向修饰导致的工艺复杂、产品稳定性差以及巨噬细胞脱靶转染等挑战，需通过优化偶联工艺和载体设计来突破当前限制。

3.2 封装核酸的聚合物纳米颗粒

阳离子型PBAE聚合物纳米颗粒通过静电自组装负载核酸（DNA/mRNA），具有pH响应性内体逃逸特性，经肽修饰后可促进其遗传物质通过微管运输快速进入细胞核。该载体具有生物可降解性（体内半衰期1-7小时）、良好耐受性和冻干稳定性优势，已成功用于T细胞体内基因工程（图2b）及巨噬细胞离体基因工程。

将聚谷氨酸缀合至靶向CD8或CD3的抗体，并将所得缀合物静电吸附至PBAE颗粒，可实现T细胞靶向递送，在白血病、前列腺癌和乙肝相关肝癌模型中展现出与传统CAR-T疗法相当的抗肿瘤效果。其中mRNA载体需多次给药维持疗效，而DNA载体虽可实现转座子介导的基因组整合（已测试CD19/ROR1等靶点），但存在插入突变风险。尽管PBAE系统在制备工艺和储存成本方面优势显著，但其封装效率、长期生物相容性等指标较LNP仍存在差距，需进一步临床转化研究。

慢病毒载体作为逆转录病毒亚类，通过基因组整合实现长效转基因表达，已被广泛用于将外源基因递送至T细胞。为提高体内靶向效率，已开发多种改造策略：（1）采用尼帕病毒/麻疹病毒等病毒囊膜假型化；（2）引入锚蛋白重复蛋白（DARPin）或scFv（如CD8/CD3靶向）增强T细胞趋向性（图2c）。实验显示，靶向CD8的单链抗体慢病毒载体可在人源化NSG小鼠中使30-50% CD8+T细胞表达CAR，有效清除淋巴瘤细胞；而CD4靶向载体转导率达40-60%，CD4+CAR-T细胞显示出更高的增殖率和对CD19 + B细胞更有效的清除，这可能是由于CD8 + T细胞更敏感。

体内直接注射T细胞靶向慢病毒可以成功地将CAR转基因递送到足够数量的宿主T细胞中，从而引起治疗反应。最近，一种改良的基于慢病毒的递送平台在非人灵长类模型中进行了测试。该载体在抗CD3 scFv的基础上加入了共刺激配体CD80和CD58，显著增强了体内CAR-T细胞的活化和抗肿瘤功能。这些载体在体内产生了CD20靶向的CAR-T细胞，该细胞占循环T细胞的65%，并导致长达76天的B细胞完全耗竭，表明它们在治疗B细胞恶性肿瘤和B细胞介导的自身免疫性疾病方面具有很好的疗效。

尽管慢病毒具有成熟的离体生产工艺和稳定表达优势，但体内应用仍面临安全性挑战：基因组整合的插入突变风险、宿主免疫反应导致的稳定性问题，以及预存抗体患者的适用性限制。当前研究证实其体内CAR-T生成的可行性，但需要对靶向细胞类型进行严格的控制，只有经过严格的安全性评估后，才可考虑用于临床试验，以批准广泛使用。

3.4 基于AAV的递送系统

腺相关病毒（AAV）是具有二十面体衣壳结构和单链DNA基因组的无包膜病毒，由于其能够实现长期转基因表达和有效的疾病表型校正，现已成为体内基因治疗的重要工具。与慢病毒载体相反，AAV DNA保持稳定的附加体形式，使其成为非常适合于体内基因操作的载体。在人源化小鼠模型中，AAV载体成功用于CD4+T细胞白血病的CAR治疗，有望在未来开发HIV及其他损害CD4+T细胞的感染性疾病的疗法。但需要注意的是，CAR-T细胞持续存活可能导致CD4+T细胞耗竭，亟待开发安全开关系统。

3.5 生物指导性可植入式支架

可植入多功能藻酸盐支架是一种介于体内和体外策略之间的混合型CAR-T细胞工程技术。与传统方法不同，这种支架能提供局部可控的微环境，增强了T细胞、病毒载体、细胞因子和趋化因子之间的相互作用。不仅提高了CAR转导效率，还能最大限度地减少与全身T细胞工程相关的潜在系统副作用（图2d）。

另一种生物可指导的植入式支架设计是基于胶原蛋白，将抗人CD3/CD28抗体、慢病毒和选择的趋化因子（如CCL21、CCL3、CCL4或CXCL10等）偶联到其中，可募集、工程化、扩增和释放肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），用于实体瘤的治疗。在乳腺癌人源化小鼠模型中，植入乳腺的支架能有效富集T细胞和CAR工程化，有利于CAR-T细胞在肿瘤部位的激活、扩增和保留，并导致显著的长期肿瘤消退。

总而言之，生物可植入支架技术开创性地将CAR-T制造与递送整合为一体化平台，特别适用于血液恶性肿瘤和浅表实体瘤（如黑色素瘤、乳腺癌），但在深部肿瘤（如肝癌、脑胶质瘤等）的应用仍面临挑战。

3.6 Cas9 --包装包膜递送载体

3.7 病毒模拟的融合型纳米囊泡

体内直接插入预制CAR蛋白是一种创新的CAR-T细胞生成方法。通过静脉注射含抗CD3 scFv和CD19 CAR的病毒模拟融合纳米囊泡（FuNVs）（图2f），可实现CAR蛋白在T细胞膜的瞬时表达。人源化小鼠模型证实，该方法产生的CAR-T细胞能有效清除CD19+B淋巴瘤细胞且不诱发CRS。未来通过优化融合蛋白的特异性和效率，可最大限度地减少与脱靶相互作用相关的潜在副作用，推动临床应用。

图2. 体内T细胞CAR工程的当前策略与机制

3.8 其他免疫细胞的体内CAR工程

基于体内CAR-T工程的成功经验，其他免疫细胞，特别是NK细胞、单核细胞和巨噬细胞的体内工程也被探索（图3）。其中，CAR-巨噬细胞因其独特的肿瘤浸润能力和内化特性备受关注。目前主要采用三种递送策略：1）纳米载体-水凝胶超结构通过CD206靶向生成CAR-巨噬/小胶质细胞，在胶质瘤模型中可诱导长期免疫记忆；2）PBAE聚合物纳米颗粒联合RP-182肽重编程M2型巨噬细胞，在ERBB2+脑干胶质瘤中展现显著疗效；3）甘露糖化载体（MPEI/MCA）通过静脉注射实现全身性递送，在胰腺癌和肝癌模型中成功激活巨噬细胞吞噬功能。此外，氧化脂质纳米粒（oLNPs）对单核细胞具有天然趋向性，可高效生成CD19 CAR-单核细胞。这些突破性进展为实体瘤治疗提供了新思路，但静脉递送效率仍需优化以实现更广泛的临床应用。除T细胞和巨噬细胞外，NK细胞、NKT细胞及中性粒细胞也被开发用于CAR工程化治疗。然而，CAR-NK疗法仍面临持久性差、转导效率低及需IL-15等细胞因子支持的三大技术瓶颈。

总的来说，利用T细胞以外的其他免疫细胞的体内工程学，利用这些细胞类型的固有特性，为CAR-T细胞提供了一个很有前途的替代方案。

图3. 临床前模型中对巨噬细胞进行体内CAR工程的示例

3.9 超越癌症的体内CAR工程

CAR技术的应用已从癌症治疗拓展至自身免疫病、感染性疾病和纤维化等非肿瘤领域。在自身免疫病方面，靶向CD19/BCMA/DSG3/CD20的CAR-T细胞可清除致病性B细胞，用于治疗系统性红斑狼疮、多发性硬化等疾病；此外，以HIV gp120糖蛋白为靶点的CAR-T疗法已进入I/II期临床。在纤维化治疗中，CD5靶向LNP递送FAP-CAR mRNA可使T细胞特异性识别活化成纤维细胞，小鼠模型显示该疗法能减少50%以上心脏纤维化并改善心功能。此外，CAR技术在哮喘、病毒性肝炎、COVID-19及阿尔茨海默病等领域都展现出治疗潜力。

4 比较体内和体外CAR工程

不同的CAR-T细胞制备方法，如体内策略，使用非整合或整合载体，以及使用自体或异体细胞的体外方法，各自具有不同的优势，但在生产工艺、疗效及安全性方面也面临独特的挑战（表1）。鉴于这些平台的多样性，对它们进行比较，可以深入了解它们各自的优势和潜在应用。

表1. 体内与常规体外自体CAR-T细胞工程的比较

当前商业化及临床试验中对体外自体CAR-T细胞疗法的需求激增，表明其生产能力存在很大的局限性。美国现有集中化生产模式下，周转时间在16-33天不等，可能导致患者治疗延误。由于活细胞产品集中生产的复杂性，通过扩大规模难以缩短周期，需要通过建立更加分散和本地化的制造设施来提升产能。但是，本地化生产所需要的设备试剂成本太高，并且自体CAR-T细胞疗法的制造和管理成本也很高。相比之下，同种异体CAR-T细胞疗法提供了一种更具成本效益的替代方案，具有更大的可扩展性和现成可用的优势。

体内CAR工程技术因其"现货型"特性为传统自体/异体CAR-T细胞疗法提供了有希望的替代方案，可显著简化质检流程、优化供应链并降低成本。但新技术平台仍存在产业化瓶颈。关于LNP-mRNA、PBAE聚合物-mRNA/DNA和AAV载体CAR技术在短期、中期和长期的安全性及有效性仍存在疑问，同时这些载体能否利用现有生产工艺实现规模化高效生产也尚待验证。

尽管体外生成的自体CAR-T细胞疗法在血液肿瘤中取得成功，但其对实体瘤的疗效仍有限。新兴的体内CAR工程技术通过在肿瘤微环境（TME）中持续改造和扩增免疫细胞，有效克服了体外CAR-T细胞持久性不足和归巢效率低等局限。与体外疗法相比，该技术具有多重优势：无需清淋预处理从而保护患者免疫系统功能；通过表位扩散维持抗肿瘤免疫应答；可同时或序贯靶向多个抗原降低肿瘤逃逸风险；非整合载体实现CAR的瞬时表达，通过间歇给药避免T细胞耗竭。这些特性使体内CAR工程不仅能与现有疗法协同克服免疫抑制性TME（图4），还保留了患者完整的免疫功能，为实体瘤治疗提供了更优解决方案。

体内CAR工程技术可通过递送siRNA来实现基因暂时沉默，从而暂时提高T细胞的活性和持久性。然而该技术面临多重挑战：初始CAR-T细胞数量较少需体内逐步扩增，虽较体外制备周期短，但对免疫功能低下患者疗效受限；药代动力学参数复杂，载体和细胞分布存在很大差异；非整合载体虽可避免T细胞耗竭但表达持续时间短，而慢病毒等整合载体又存在插入突变风险；此外，宿主体内预存免疫可能加速载体清除，影响多次给药效果。这些因素共同制约着体内CAR工程的临床应用。

图4. 体内CAR工程联合疗法

与自体CAR-T疗法相比，体内CAR工程技术具有显著安全性优势：无需清淋化疗避免相关风险；非整合载体实现剂量实时调整，可显著降低毒性和长期副作用；基于mRNA和AAV载体的成熟安全性经验（经COVID-19疫苗验证）加速临床转化；纳米颗粒和mRNA可以以无细胞的方式生产，可最大限度地减少产品的变异性，确保产品质量均一；以mRNA和AAV为基础的治疗不会带来插入突变的风险，而体外CAR-T细胞的生产往往依赖于病毒载体的整合，如慢病毒或逆转录病毒载体，这些病毒载体具有插入突变的风险。尽管有其优势，但体内CAR工程仍面临挑战：高载体剂量需求可能引发肝毒性等剂量限制性毒性；载体介导的炎症反应虽可能增强抗肿瘤免疫，但也可导致CRS样症状。尽管慢病毒载体更稳定和持久的CAR表达，但它们永久地整合到宿主基因组中，存在长期脱靶效应的风险。鉴于以上问题，目前非整合载体或位点特异性整合载体比慢病毒载体更适合用于体内CAR工程，以提高安全性并最大限度地减少基因组破坏。

随着体外CAR工程的技术革新，以及不断发展的免疫学见解，为体内CAR工程的发展提供了重要的技术参考和理论支持。特别是近期通过优化制备流程缩短生产周期、减少细胞耗竭以及增强记忆性和效应功能等方面取得的研究进展，为提升自体CAR-T细胞治疗效果提供了新的技术路径，这些成果可直接转化应用于体内CAR工程的技术优化和临床转化。总的来说，体内CAR工程这一新兴领域有望在医疗领域取得实质性进展。为了将其确立为一种新的治疗模式，需要产学研协同攻克免疫应答、靶向递送等核心挑战，同时在伦理规范下优先在难治性癌症等适应症开展临床试验。

Li YR, Zhu Y, Halladay T and Yang L. Nature Reviews Immunology, 2025, May 16th, In vivo CAR engineering for immunotherapy.