Nature综述：RNA的化学修饰与药物开发

基于RNA的疗法在临床取得实质性进展，这主要得益于RNA分子独特的化学和生物学特性。多种RNA药物获批表明，RNA疗法早期面临的一些挑战，如大规模生产、有效递送和免疫原性问题，目前正逐步得到解决。大量研究致力于通过化学修饰RNA分子来提高其稳定性、增加蛋白产量、延长循环时间并改善靶向特异性。目前，三类RNA：小RNA、可翻译RNA和CRISPR向导RNA正在被广泛开发用于治疗应用。本综述总结了应用于这三类RNA的合成方法，描述了用于增强其性能的关键化学修饰策略，并重点介绍了当前的治疗应用及未来的发展机遇。

基于RNA的疗法代表了一类新兴的治疗手段，因其独特的理化性质和生理学特性，已彻底改变了多种疾病的治疗模式，并日益受到关注。具体而言，基于RNA的治疗药物可通过靶向基因组、mRNA和蛋白质来精确调控基因转录和蛋白质表达，从而最大限度地减少治疗过程中的脱靶效应和不良反应。与传统的化学小分子药物相比，RNA疗法还具有可快速设计和生产的显著优势，尤其针对新发现的靶点。此外，给药剂量和频率的灵活性也增强了其在临床实践中的应用性。

在过去十年中， FDA已批准了多种基于RNA的疗法。尽管取得了显著进展，但RNA疗法仍面临与生产、有效递送和安全性相关的若干重大挑战。

对RNA的直接修饰和改进递送系统是目前RNA疗法领域的主要研究焦点。临床证据表明，化学修饰RNA可通过提高稳定性、增加蛋白产量、优化递送效率、增强靶向亲和力以及最大限度地减少脱靶效应来提升疗效。因此，整合化学修饰是推进和优化基于RNA疗法的关键。

图一：已获批的RNA相关疗法

小RNA是天然存在或合成的短寡核苷酸，对调节各种生物靶点至关重要。这些分子通常通过靶向特定分子（基因或蛋白），并借助多种机制（如基因沉默、空间位阻、剪接调节、调整蛋白质翻译过程或调控靶蛋白活性）来影响其功能。凭借其精准靶向特定基因序列的能力，其治疗应用范围涵盖从病毒感染到遗传性疾病的广泛领域。小RNA参与多种生物过程，其中包括siRNA和miRNA等已充分表征的类别。小RNA治疗药物的开发基于早期关于反义寡核苷酸（ASO）的众多研究。ASO分子通常由短的单链DNA和/或RNA序列组成，旨在调节蛋白质表达。此外，适配体（aptamers）作为合成短单链寡核苷酸，能够形成独特的三维结构，从而实现对特定分子的精准靶向识别。

ASO、siRNA、miRNA和适配体通过不同的机制发挥作用。裂解型ASO与特定的前mRNA和mRNA结合，触发核糖核酸酶H（RNase H）的募集，从而导致mRNA降解和致病基因的下调。空间阻滞型ASO可通过阻碍mRNA与核糖体亚基的相互作用来抑制翻译。此外，剪接切换型ASO可调节剪接过程，促进外显子跳跃或外显子包含，而不降解mRNA。siRNA是一种双链RNA，由过客链（正义链）和向导链（反义链）组成，启动RNAi过程。一旦进入细胞并整合到RNA诱导沉默复合物（RISC）中，siRNA与Ago2相互作用，促进双链解旋并导致过客链降解。剩余的向导链与靶mRNA互补，使RISC复合物结合并切割特异性mRNA，从而有效抑制基因表达。miRNA是一类小分子非编码RNA，通过RISC广泛调控基因表达。它们与靶mRNA上的特定序列结合，导致翻译抑制和mRNA降解。与ASO、siRNA或miRNA不同，适配体通常具有明确的结构，可折叠成多种二级结构，进而组装成独特的三维形态，实现对特定靶分子的精确识别。适配体通过疏水和静电力、范德华力、氢键、形状互补性和碱基堆积等多种相互作用表现出高结合特异性和亲和力。

目前，固相合成和酶促合成是制备小RNA的两种主要方法。由于其显著优势和广泛适用性，这些方法最为常用。

固相RNA合成。基于亚磷酰胺化学的固相RNA合成包括脱保护、偶联、封闭和氧化等重复循环，以延伸连接到固相载体上的核苷酸序列。这些循环使反应能够快速完成，并得益于计算机控制的自动化，从而便于轻松制备高纯度的复杂RNA序列。由于该技术在合成具有多种化学修饰的寡核苷酸和偶联物方面具有灵活性，因此仍是制造临床相关小RNA的首选方法。

使用亚磷酰胺化学的固相RNA合成通常限于合成少于200个核苷酸的序列且批量小于10 kg的产物。当引入某些化学修饰时，小RNA的收率和纯度会显著下降。这主要是由于合成长RNA序列需要更长的反应时间，导致副产物增加，且需要复杂的纯化步骤。

硫代磷酸酯（PS）键是最早修饰类型之一，已被证实能增强小RNA的功效，并被应用于多种经FDA批准的小RNA药物中。PS修饰的一个结果是手性中心的形成，这使得分子可以采用Rp或Sp构型。在固相合成中，每次亚磷酰胺偶联反应都会形成一个新的PS键，通常导致立体异构体的混合物。这些立体化学变异影响最终治疗性寡核苷酸的药理学特性和效果。

固相RNA合成仍是制备小分子RNA的主要方法。然而，各种核酸修饰带来的结构复杂性给修饰RNA的合成带来了挑战。此外，迫切需要创新技术和方法来提高较长RNA序列的收率。

小分子RNA的酶促合成。此外，还可以通过酶促合成制备长度从几个到数千个核苷酸不等的小分子RNA。该方法效率极高，且与天然生化过程高度吻合。DNA或RNA连接酶可用于将短RNA片段组装成更长的链，这一过程称为汇聚式化学酶法合成。此外，该方法还能减少固相RNA合成中常见的杂质，例如截短序列。例如，连接酶通过利用三磷酸腺苷（ATP）或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）激活片段的5′-单磷酸基团，从而促进片段组装。这种活化作用有助于与另一个片段的3′-OH基团形成键，从而提高所合成序列的一致性和完整性。

尽管小RNA的酶促合成前景广阔，但必须注意的是，并非所有经化学修饰的核苷酸都与酶兼容。此外，目前酶促合成尚无法在指定位置引入特定的化学修饰，且仅限于生成PS键的Rp构型。需要对这些挑战进行进一步的研究和探讨。

图二：小RNA的合成方式

化学修饰通过提高安全性、稳定性、特异性及其他药理学特性，增强了小RNA的治疗潜力；未经修饰的RNA通常活性较低且降解迅速。修饰可发生在小RNA的各种结构组分上，包括核糖、主链和核苷酸碱基。例如，对核糖的修饰可增强稳定性、降低免疫原性、改善药代动力学特性、提高靶序列亲和力并最大限度地减少脱靶效应。主链修饰可提高稳定性、药代动力学特性和生物活性，而碱基修饰则能降低免疫原性并进一步增强稳定性。这些进步降低了所需的治疗剂量，减轻副作用，并解决了脱靶效应等重要挑战，从而使小RNA更适合广泛的临床应用。

反义寡核苷酸（ASO）的化学修饰。2′-核糖修饰和桥联核酸（BNA）类似物是小RNA中常用的修饰方式。特别是2′-MOE、受限乙基桥联核酸（cEt）和锁定核酸（LNA），已在基于ASO的治疗药物中得到了广泛研究。将亲核性2′-OH基团替换为2′-MOE的方法已应用于FDA批准的ASO药物中，该方法可增强ASO的抗核酸酶性及RNA结合亲和力，并减少促炎作用。作为BNA变体的cEt和LNA能够降低核苷酸的构象灵活性并增强结合亲和力，目前仍在持续研究中。此外，经2′-氟-β-d-阿拉伯核苷酸、胍桥接核酸和2′-O,4′-C-乙烯桥接核酸修饰的ASO表现出高稳定性和对互补RNA的强亲和力。例如，FANA修饰的ASO已发现可通过阻断重复区域并防止R-loop形成，在Friedreich共济失调中恢复frataxin表达。与LNA修饰的ASO相比，胍桥连核酸修饰的ASO增强了骨骼肌和肝脏的摄取，同时降低了肝毒性。

研究发现，在第二个缺口位置引入单个2′-O-甲基（2′-OMe）修饰，可在不影响靶向活性的前提下，通过最大限度地减少与旁斑蛋白的不良相互作用并防止RNase H切割非靶向RNA，从而降低毒性。在多个ASO序列中，对特定位点应用2′-OMe修饰的有效性已得到验证，这有助于开发出潜在不良反应更少的ASO。尽管取得了这些令人鼓舞的结果，但目前尚未有含2′-OMe修饰的ASO药物获得批准。然而，包括PS键和磷酰二酰胺基莫尔福林寡核苷酸（PMOs；用于生成电荷中性的核酸，其中典型的五元核糖环被六元莫尔福林环取代）在内的主链修饰，已被广泛应用于众多经FDA批准的ASO药物中。特别是，PS键将非桥接氧原子替换为硫原子，在保持RNase H活性的同时，通过增强抗核酸酶性来提高ASO的稳定性。

将ASO与各种功能基团（如脂质、抗体和配体）进行共价偶联，是另一种能够改善组织分布并减少脱靶相互作用的化学修饰策略。例如，据报道，将胆固醇或α-生育酚连接到治疗性ASO的5′端，可促进静脉注射后ASO穿过血脑屏障。此外，已开发出抗体偶联ASO，用于临床试验中针对特定组织的靶向递送。例如，在治疗1型肌强直性营养不良时，与靶向转铁蛋白受体1（TfR1）的片段抗体偶联的ASO被有效递送至肌肉组织，并降低了毒性DM蛋白激酶（DMPK）RNA的水平。

siRNA的化学修饰。2′-OM、2′-F和PS键等化学修饰是siRNA两条链上应用最广泛且最优化的修饰方式。这些修饰的组合可增强结合亲和力、提高抗核酸酶性、延长基因沉默持续时间，并降低先天免疫激活和毒性。包括吉沃西兰（givosiran）、卢马西兰（lumasiran）、英克利西兰（inclisiran）、武特西兰（vutrisiran）和内多西兰（nedosiran）在内的多种已获临床批准的siRNA药物均采用了这些修饰。早期研究表明，在siRNA引导链上引入2′-O-苄基及其吡啶衍生物2′-O-甲基-4-吡啶等修饰，可延长体内基因沉默作用的持续时间。此外，将2′-OMe与磷酰二硫酸酯(PS2)结合，可通过促进其装载到RISC中来增强siRNA的稳定性。当将这些修饰应用于针对GRAM结构域含蛋白1B（GRAMD1B）的siRNA时，在化疗耐药性卵巢癌小鼠模型中，与紫杉醇联合使用可产生显著的抗肿瘤效果。此外，以热不稳定性著称的乙二醇核酸（GNA）修饰已被用于siRNA疗法中，以最小化脱靶效应和肝毒性。Alnylam公司采用这种GNA修饰策略（称为增强稳定化学加（ESC+）），应用于多种siRNA产品（包括ALN-HBV02），以实现种子配对去稳定化并提高治疗指数。

共价偶联是另一种用于提高siRNA递送效率或治疗潜力的修饰策略。例如，GalNAc-siRNA偶联物已被证明可有效将siRNA递送至肝细胞用于临床应用。随后，开发了一种通过将两个单体siRNA共价连接成二价结构（称为di-siRNA）来增强脑内siRNA效果的方法。该连接通过一个连接子在正义链的3'端进行。在单次脑脊液给药后，di-siRNA可在小鼠和非人灵长类动物的CNS中实现持续基因沉默。在野生型小鼠中，该方法使所有检查脑区的HTT蛋白水平降低超过80%，在单次脑室内给药后长达6个月内，丘脑和纹状体的浓度低于50%。然而，带负电荷的siRNA或ASO可能会导致神经毒性。这种风险源于它们能够与脑脊液中或细胞内的二价阳离子（如钙和镁）结合。通过在制剂中添加钙和镁阳离子，可能有助于缓解急性神经毒性。

miRNA的化学修饰。ASO和siRNA中使用的许多化学修饰策略也可应用于增强miRNA的功能，包括mimics和antagomirs。这些修饰有助于miRNA整合到RISC中，并提高其对核酸酶的抵抗力。例如，RGLS4326是一种由cET、2′-OMe和2′-F完全修饰的9核苷酸抗miR-17 miRNA，其体内药代动力学特性得到改善，并表现出优先分布于肾脏的特性。RGLS4326可解除miR-17靶基因（包括小鼠基因Pkd1和Pkd2）的抑制，目前已开发用于通过皮下给药治疗常染色体显性多囊肾病。

适配体的化学修饰。RNA适配体利用小RNA的化学修饰策略并结合PEG化（聚乙二醇修饰）来增强适配体亲和力和药代动力学特性。这种组合修饰已应用于多种经FDA批准和正在临床研究中的RNA适配体，例如佩加普坦尼布（靶向VEGF）、阿瓦辛卡普塔德佩戈尔（靶向补体C5）和REG1（靶向凝血因子IXa）146–148。此外，当前的研究重点在于进一步修饰RNA适配体以满足多种应用需求。例如，经2′-F修饰并与胆固醇偶联的RNA适配体（胆固醇-适配体）能够高效穿透细胞并抑制丙型肝炎病毒RNA的复制。将PS2引入抗凝血酶RNA适配体的结构中，可提高其对凝血酶靶标的亲和力。 经2′-F修饰的RNA适配体GL44已被应用于胶质母细胞瘤的硼中子俘获疗法，在实现靶向递送的同时降低了毒性。

小结 化学修饰对于优化ASOs、siRNAs、miRNAs和适配体的稳定性、特异性和功效至关重要，而每类分子都需要根据其作用机制和序列组成进行独特的修饰。当前小RNA的修饰主要集中在主链和糖基上，以及与特定分子的共价偶联。由于小RNA本身长度较短，即使微小的或不完整的位点修饰也会显著影响其稳定性、代谢、毒性和结合亲和力。 临床数据和基于AI的设计工具为优化小RNA的糖基、主链和碱基上的化学修饰提供了宝贵的见解，从而增强其效力并最大限度地降低毒性。此外，这些修饰也可应用于长可翻译RNA，如mRNA、circRNA和saRNA，以改善其耐久性、翻译效率和免疫原性特征，用于治疗应用。

可翻译RNA是指一类能够被核糖体翻译并表达功能性蛋白的RNA分子。可翻译RNA的主要类型包括mRNA、circRNA和saRNA。临床上使用的基于mRNA的治疗药物通常设计为模拟真核细胞胞浆中内源性mRNA的结构，其具有明显的a-帽、非翻译区（UTRs）、编码序列区和聚（A）尾。 环状RNA（CircRNA）是天然存在的分子，其特征为共价闭合环结构，由线性RNA前体通过一种称为可变剪接的过程产生。该过程涉及外显子或内含子的环化，从而形成独特的闭合环形状。与线性mRNA相比，环状RNA具有固有的稳定性，这主要归因于其缺乏传统的5′帽结构和3′多聚(A)尾，从而使其能够抵抗外切酶的降解。为了启动翻译，环状RNA需要在内部核糖体进入位点（IRES）中添加相应元件，或在UTR中引入N6-甲基腺苷（m6A）修饰。从结构上看，saRNA与线性RNA相似，但额外包含编码RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）复合物的序列。此外，编码序列区域的上游还存在一个亚基因组启动子，用于驱动表达。这种结构使saRNA能够在细胞内自我复制和扩增，从而实现靶蛋白的持续生产。

mRNA 分子可通过化学或酶法合成。然而，体外转录（IVT）更受青睐，因为它能产生长序列的 mRNA，而化学合成通常无法实现这一点。在无细胞过程中，IVT利用源自噬菌体的DNA依赖性RNA聚合酶，以线性DNA模板（源自质粒或PCR产物）为模板合成RNA。可通过限制性内切酶在特定序列处切割质粒DNA，以获得线性的IVT模板。最常用的RNA聚合酶包括T7、T3或SP6，它们均来自不同的噬菌体，主要区别在于其特异性启动子序列。为了模拟成熟mRNA的结构，在IVT过程中或之后添加poly(A)尾和帽结构。生成poly(A)尾结构主要有两种方法。第一种方法使用重组poly(A)聚合酶进行酶促转录后添加。然而，这种方法通常缺乏精确控制poly(A)尾特定长度所需的一致性。第二种方法是将确定长度的poly(A)直接纳入DNA模板。该方法已有效用于SARS-CoV-2 mRNA疫苗的开发，因为它可以更精确地控制最终poly(A)尾的长度。此外，IVT产物可通过两种策略加帽：转录后加帽（在IVT反应后通过酶促添加帽）和共转录加帽（在IVT过程中同时整合帽类似物）。IVT反应结束后，反应混合物通常需经DNase消化以去除DNA模板，随后采用氯化锂（LiCl）沉淀或结合切向流过滤的色谱法进行纯化。亲和分离是另一种mRNA纯化方法。

通常，circRNA是通过将一个或多个前体线性RNA环化而产生的。该过程涉及化学、酶促或核酶连接方法，以共价闭合线性前体RNA的环。溴氰化物（BrCN）或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺常被用作化学缩合剂，以实现RNA的环化。另一种方法是通过诱导形成将5′端和3′端拉近的二级结构，使线性RNA前体发生环化。通常通过在RNA分子的两端连接短寡核苷酸，或在线性RNA的两端引入互补的碱基配对序列来实现这一点。这种结构安排促进了两端的退火，从而导致环化。

一种利用重排的I组催化内含子（PIE）的核酶策略，能够有效将长RNA序列环化，且仅需GTP和Mg²⁺作为辅因子。重排内含子-外显子（PIE）剪接方法将部分外显子融合在一起，并由半内含子序列包围。这种构型使构建体能够进行双酯交换反应，这是I组催化内含子的特征性过程。该过程导致外显子被切除并环化，形成从5′端到3′端共价连接的环状结构。基于PIE的方法已被用于制备能够将长达5 kb的序列环化的环状RNA（circRNA）。通过在前体RNA的5′端和3′端引入互补的同源臂，使剪接位点在空间上更接近，从而提高了该方法的环化效率。同样，PIE介导的方法已被用于生成编码SARS-CoV-2受体结合域抗原的circRNA疫苗。该circRNA疫苗增强了刺突蛋白三聚体受体结合域的表达，从而刺激中和抗体和T细胞反应的产生。最近，研究人员采用优化的PIE方法合成了含有短双链区域的环状RNA（ds-cRNA），通过缩短多余序列来降低免疫原性并提高稳定性。这些ds-cRNA经过专门设计，旨在抑制双链RNA激活的蛋白激酶R（PKR）的活性。在咪喹莫德诱导的银屑病小鼠模型中，具有高PKR结合亲和力的ds-cRNA有效抑制了下游干扰素-α信号传导，从而缓解了炎症和疾病症状。 以核酶自剪接能力著称的II组内含子，也被用于环状RNA（circRNA）的制备，从而扩展了circRNA合成的工具库。

saRNA的制备与线性mRNA类似，首先使用质粒DNA模板，该模板不仅包含目标蛋白的序列，还包含源自α病毒的必需复制子元件。这些元件至关重要，因为它们编码非结构蛋白1至4（nsP1–4），这些蛋白质是细胞内RNA复制所必需的。与IVT mRNA类似，转录后，saRNA可在5'端加帽以促进翻译，最终产物纯化后使用。

碱基修饰。天然RNA中的化学修饰最早于20世纪60年代被发现。自那时以来，人们已发现内源性RNA中存在多种修饰，这些修饰会影响基因转录和蛋白翻译。越来越多的研究表明，在可翻译RNA中引入化学修饰，既能降低免疫原性反应，又能提高可翻译RNA的稳定性和蛋白产量。四种RNA核苷（腺苷（A）、鸟苷（G）、胞苷（C）和尿苷（U））均存在修饰。其中，尿苷的异构体——假尿苷（Ψ），是合成可翻译RNA中观察到的主要转录后修饰。有报道称，经Ψ修饰的RNA可减弱TLR信号传导，从而最大限度地降低先天免疫系统对外源转录RNA的反应。这一突破为mRNA疫苗技术的重大发展铺平了道路。随后，有研究表明Ψ修饰会影响RNA依赖性PKR、2′-5′-寡腺苷酸合成酶（OAS）和RNase L的活性，这些酶通常通过与mRNA相互作用来抑制翻译活性。其他修饰，如Ψ和m5C，通过降低TLR信号传导和PKR激活，在小鼠体内提高了蛋白质翻译水平。N1-甲基假尿苷（m1Ψ）作为一种甲基化的Ψ形式，已在当前的mRNA平台中得到广泛应用。例如，经m1Ψ修饰且编码寨卡病毒prM-E蛋白的mRNA，能够在小鼠和恒河猴体内诱导保护性免疫应答。利用编码自身免疫性疾病靶抗原的m1Ψ修饰mRNA，可在非炎性环境中促进与 CD11c+ 抗原呈递细胞的体内相互作用。将m1Ψ引入mRNA疫苗中，提高了其在预防COVID-19方面的效力。

序列与结构修饰。可翻译RNA的序列及其结构组分（包括UTR、5′帽结构和多聚A尾）对RNA的功能至关重要。5′和3′UTR均可调节RNA的稳定性和翻译效率。常用的UTR源自α-珠蛋白和β-珠蛋白mRNA，已证实能同时提高合成mRNA的稳定性和翻译效率。 高通量筛选技术加速了能够增强IVT mRNA蛋白产量的全新3′UTR序列的鉴定。对64种UTR组合的评估表明，携带AES-mtRNR1 3′UTR的mRNA不仅提高了翻译效率，还能在小鼠体内激发抗原特异性T细胞应答。深度学习和AI是优化可翻译RNA序列的重要工具。通过深度学习方法分析人类5' UTR序列的综合文库，发现了可最大化mRNA翻译效率的最佳5' UTR序列。

5'帽结构在保护mRNA免受核酸外切酶降解、从而保持其稳定性和促进翻译起始方面起着关键作用。在真核细胞中，成熟的mRNA通常以N7-甲基鸟嘌呤（m7G）开头，该基团通过三磷酸桥（ppp）与第一个核苷酸相连，形成m7G帽（m7GpppNp）。 帽结合复合物（CBC）协助将5′端带帽的mRNA运出细胞核，而真核翻译起始因子4E（eIF4E）则有助于启动翻译。帽结构主要有三种类型：cap0、cap1和cap2，它们的区别在于甲基化程度。最新研究结果表明，circRNA上的m7G修饰可能提高翻译效率。通过将带有m7G帽的支链结构共价连接到环状RNA上，可以激活一种由内部帽启动的机制。当与m1Ψ修饰相结合时，这种方法既能增强环状RNA的翻译效率，又能降低免疫应答。此外，将m7G修饰的寡核苷酸与环状RNA杂交，也能提高翻译效率。

Poly(A)尾通过保护编码区免受降解和去腺苷酸化酶的降解来调节mRNA的稳定性和半衰期。用于小RNA的某些化学修饰也已整合到可翻译RNA中，以增强其稳定性和翻译效率。将叠氮修饰的腺苷核苷酸整合到poly(A)尾中，可在不改变潜在遗传信息的情况下增加报告蛋白的表达。最近，mRNA被设计为具有分支poly(A)尾，所得物种被称为多尾mRNA。这些特殊尾部促进与细胞质poly(A)结合蛋白（PABP）的多聚体相互作用。将化学修饰（PS和2'-MOE）和分支拓扑结构结合到这些尾部，可有效保护mRNA免受降解，从而在不增加免疫原性的情况下延长体内蛋白翻译的持续时间。

图三：可翻译RNA的化学修饰

小结 对mRNA、circRNA和saRNA等可翻译RNA进行化学修饰，需要进行仔细优化，以平衡稳定性、翻译效率和免疫原性。研究表明，碱基修饰（如m¹Ψ和m5C）可在增强 mRNA 稳定性和翻译效率的同时，降低先天免疫传感器的激活。这些修饰可调节密码子-反密码子相互作用和核糖体动力学，从而提高蛋白质产量和翻译保真度，但需谨慎选择和定位，以避免对翻译元件产生意外影响。具体而言，将多种化学修饰结合到单一可翻译RNA上的合成策略可能会影响其稳定性或翻译效率。其他需要考虑的因素包括编码序列优化、翻译起始效率以及tRNA识别，以确保准确高效的蛋白质合成。修饰之间的兼容性对于保持RNA功能至关重要，而降低先天免疫激活仍是主要挑战。从小RNA修饰中获得的见解可为可翻译RNA设计提供参考，RNA工程和化学修饰的新兴策略有望实现延长的和可控的翻译。

CRISPR引导RNA的合成

引导RNA可通过多种方法制备，其中以IVT和化学合成最为突出。通常，用于制备引导RNA的IVT方法与mRNA的合成方法类似。IVT方法利用T7 RNA聚合酶，以通过PCR扩增的线性DNA模板为模板合成引导RNA。然而，所产生的引导RNA可能会引发免疫反应。具体而言，由于存在5′-三磷酸基团，引导RNA可能会被RIG-I识别。RIG-I的激活会触发I型干扰素反应，导致细胞死亡。为减轻这些免疫反应和细胞毒性效应，采用磷酸酶去除5′-三磷酸基团等方法在人体细胞中已显示出一定效果。除IVT外，如前文讨论小RNA部分所述，还可通过固相合成法合成引导RNA，从而制备具有明确化学序列和修饰的引导RNA。由于其精确性、可扩展性以及能够引入增强稳定性并降低免疫原性的化学修饰，化学合成是指导RNA符合良好生产规范（GMP）生产中广泛采用的方法。该方法特别便于引入位点特异性修饰，例如2′-OMe或PS连接基团，这些修饰对于治疗应用往往至关重要。然而，当引导RNA的长度增加到约100个核苷酸时，其收率和纯度均可能下降，因此必须进行仔细的表征。需要采用严格分析方法（包括高效液相色谱法（HPLC）和质谱法），以确保产品符合GMP标准。此外，还开发了通过“点击化学”连接较短RNA片段等策略。例如，可通过“点击化学”将一个带有5′-己炔修饰的65核苷酸tracrRNA与一个带有3′-叠氮基团的34核苷酸crRNA连接起来，从而制备出引导RNA。同样地，引导RNA可分为20个核苷酸的可变序列和79个核苷酸的与Cas9结合的不变序列，随后利用铜催化的叠氮基-炔烃环加成反应将其连接起来。此外，还开发了一种酶促合成策略，通过将短RNA序列连接起来制备引导RNA。通过连续进行两轮限制性酶切和连接反应，成功合成了引导RNA。这些“点击化学”和酶促合成策略有助于克服传统化学合成的局限性，从而能够制备长序列且化学结构明确的引导RNA。随着临床对复杂和修饰型引导RNA需求的增长，这些模块化方法可提供灵活且可扩展的解决方案，符合治疗应用中良好生产规范的要求。

CRISPR引导RNA的序列工程与化学修饰

临床应用中RNA分子的化学修饰

PS修饰在治疗性RNA的开发中被广泛使用，因为它能增强核酸酶抗性、减少肾脏清除并延长体内循环。另一种方法是利用PMO修饰，在杜氏肌营养不良症（DMD）患者体内恢复部分功能性截短型肌营养不良蛋白的生成。

2′-MOE是一种常用于基因沉默的修饰，特别是在ASO中。同样，其他2′修饰（如2′-OMe与2′-F的组合）也被应用于多种siRNA药物中。此外，共价偶联递送平台（如GalNAc修饰的RNA）可增强某些siRNA和ASO靶标向肝脏的递送。在过去十年中，越来越多的针对多种疾病的化学修饰RNA疗法已进入不同阶段的临床试验。

化学修饰是提高RNA稳定性、疗效和安全性的最有效策略之一。学术界和工业界数十年的广泛努力已产生大量修饰，这些修饰已在RNA分子中得到精心优化，以增强其药理学特性，如理化性质和疾病相关组织中的蓄积。

RNA疗法的安全性特征仍需仔细评估，特别是在免疫原性和脱靶效应方面。RNA递送系统（如LNP）在保护RNA载荷免受降解以及促进高效细胞摄取方面发挥着至关重要的作用。然而，无论是LNPs还是化学修饰的RNA，都可能引发免疫识别，从而导致促炎通路和免疫细胞的激活。尽管Ψ或m1Ψ等化学修饰可降低先天免疫激活，但某些修饰可能会干扰内源性RNA的加工，从而可能增加脱靶效应和免疫原性。此外，无论是递送系统还是修饰后的RNA引起的长期免疫刺激，都可能导致细胞或组织毒性，这引发了人们对治疗应用中长期安全性的担忧。 对于需要持续或反复治疗的慢性疾病，修饰RNA分子的长期安全性尤为关键。由于某些RNA修饰在体内的调控机制尚未完全阐明，因此有必要开展进一步研究，以探索可能出现的慢性毒性、累积效应及延迟性不良反应等风险。此外，选择适当的给药途径对于精准靶向特定组织、促进RNA高效进入细胞以及最大限度地减少基于RNA的治疗药物潜在副作用至关重要。

尽管目前已开发出数百种RNA化学修饰，其中部分已成功应用于RNA疗法，但我们相信仍有更多尚未被发现。展望未来，新兴的化学方法将在揭示这些未知RNA修饰方面发挥关键作用。高通量筛选技术和先进的测序方法等技术将使我们能够分析新的化学结构、探索RNA修饰，并研究其功能及潜在的生物学机制。人工智能和机器学习工具的整合也在彻底改变RNA修饰的研究，使我们能够分析大规模测序数据，识别与已知RNA修饰相关的模式和特征，并将这些信息应用于检测和分类新的修饰。基于RNA的疗法已为多种疾病的治疗开启了充满希望的新时代。随着化学修饰平台的不断开发和应用，RNA疗法的未来不仅前景广阔，而且有望推动医疗技术创新，从而改善患者预后。随着RNA修饰在人类生理和病理中重要性的日益被认识，我们预计RNA疗法将成为一类重要的药物。

Siyu Wang et al., Nature Reviews Drug Discovery 24, 828–851 (2025): RNA chemistry and therapeutics.