罗丹明荧光染料标记蛋白定制｜偶联与荧光修饰

罗丹明类染料（Rhodamine）是蛋白荧光标记中较经典的红色荧光探针系列之一，激发/发射波长通常在540-590nm区间，亮度高、光稳定性好，非常适合与FITC（绿色）搭配进行双色成像。Sur-Release公司、重组蛋白、白蛋白、乳铁蛋白等）提供罗丹明偶联的全流程定制服务。

图1｜罗丹明荧光染料标记蛋白定制｜偶联与荧光修饰

◆ 一、相关产品推荐

✦ 产品 ｜ 说明 ｜ 适用场景

✦ RB-HSA｜ 罗丹明B标记人血清白蛋白 ｜ 药物载体示踪、蛋白纳米粒成像

✦ RB-EGFP｜ 罗丹明标记绿色荧光蛋白 ｜ 多色成像、蛋白互作追踪

✦ N3-PEG-RB｜ 叠氮修饰PEG-罗丹明B｜ 点击化学偶联DBCO/炔基化蛋白

✦ DSPE-PEG-Rhodamine｜ 磷脂-PEG-罗丹明 ｜ 脂质体/LNP的荧光标记与追踪

✦ HA-RB｜ 透明质酸-罗丹明 ｜CD44靶向的荧光探针，肿瘤/干细胞成像

服务流程：客户提供目标蛋白信息（种类、纯度、缓冲体系、是否含游离氨基/巯基干扰物）→ Sur-Release技术团队推荐染料选型与偶联路径 → 定制合成 → 质控（HPLC纯度、紫外/荧光光谱确认）→ 交付。

如需针对具体蛋白（酶、重组蛋白等）讨论罗丹明偶联方案，可直接联系Sur-Release技术团队获取选型建议。

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◆ 二、蛋白偶联的化学路径

罗丹明与蛋白的偶联主要依赖蛋白表面赖氨酸残基的 ε-氨基 或N端α-氨基，少数情况下可利用半胱氨酸巯基。

路径一：异硫氰酸酯-氨基偶联（RBITC/TRITC）

异硫氰酸酯基团（-N=C=S）与蛋白伯胺在弱碱性条件下反应，形成稳定的硫脲键。关键控制点：

缓冲体系：推荐0.1 M碳酸氢钠/碳酸盐缓冲液，pH 8.5-9.0，避免使用Tris、甘氨酸等含氨基缓冲液（会竞争消耗染料）

染料溶解：用无水DMSO新鲜配制（1-10mg/mL），避光操作

投料比：通常染料:蛋白摩尔比10-20:1，具体需优化

路径二：NHS酯-氨基偶联

NHS-罗丹明与蛋白伯胺在弱碱性条件下快速反应，形成酰胺键。反应速率较异硫氰酸酯更快，但NHS酯在水溶液中易水解，需注意：

缓冲液pH 7.5-8.5为佳

染料需现配现用，避免长时间存放导致活性酯水解

路径三：磺酰氯-氨基偶联（Lissamine/Texas Red）

磺酰氯基团与伯胺反应形成磺酰胺键。该路径的偶联产物化学稳定性和光稳定性通常优于异硫氰酸酯版本。关键控制点：

缓冲液推荐0.1 M碳酸盐/碳酸氢盐，pH 9.0-10.0（磺酰氯反应最佳pH偏碱性）

染料溶解：用DMF而非DMSO（DMSO会与磺酰氯反应）

投料比：每mL蛋白溶液（1-5mg/mL）加入50-100 μL染料溶液（1-2mg/mL）

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◆ 三、可选的罗丹明染料类型

Sur-Release公司储备的罗丹明类探针覆盖从经典到近红外的多个波长选择：

✦ 染料类型 ｜ 简称 ｜ 激发/发射（nm） ｜ 活性基团 ｜ 适用场景

✦ 罗丹明B异硫氰酸酯 ｜RBITC｜562 / 582｜ 异硫氰酸酯（-NCS） ｜ 抗体、酶、常规蛋白标记

✦ 四甲基罗丹明异硫氰酸酯 ｜TRITC｜ ~550 / ~570｜ 异硫氰酸酯 ｜ 与FITC双标，免疫荧光

✦ 磺基罗丹明B磺酰氯 ｜Lissamine Rhodamine B｜556 / 576｜ 磺酰氯 ｜ 需要更长波长、更耐光的蛋白偶联

✦ 德克萨斯红磺酰氯 ｜Texas Red｜589 / 615｜ 磺酰氯 ｜ 双标中与FITC重叠最小，量子产率高

✦ NHS-罗丹明 ｜ — ｜ 依具体衍生物 ｜NHS酯 ｜ 通用氨基偶联，反应快速

✦ 叠氮修饰罗丹明 ｜N3-PEG-RB｜554 / 580｜ 叠氮 ｜ 点击化学偶联，需DBCO/炔基化蛋白

选型逻辑：若蛋白来源方便、可接受伯胺随机标记，首选RBITC或NHS-罗丹明；若需要双标且与FITC通道分离度最大化，推荐Texas Red；若蛋白需经点击化学位点特异性偶联，可选N3-PEG-RB。

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◆ 四、定制案例

案例一：RB-乳铁蛋白（RB-Lactoferrin）

客户场景：乳铁蛋白的细胞摄取追踪、靶向分子示踪。

定制方案：乳铁蛋白含赖氨酸氨基和半胱氨酸巯基两类亲核位点。采用RB-NHS酯路径时，优先在pH 7.2-8.5下与赖氨酸偶联；若需巯基定向偶联，可选择含马来酰亚胺或巯基反应基团的罗丹明衍生物。反应在室温或低温避光进行2-12小时，避免蛋白变性和荧光淬灭。

图3｜案例一：RB-乳铁蛋白（RB-Lactoferrin）

案例二：RB-EGFP（罗丹明标记绿色荧光蛋白）

客户场景：多重荧光通道标记实验，同一实验中追踪不同蛋白或细胞组分。

定制方案：将罗丹明B通过共价偶联连接至EGFP，使复合物同时保留EGFP的绿色荧光和RB的红色/近红外荧光特性，实现多通道可视化。该案例适用于需要在一个样品中同时追踪蛋白定位与蛋白互作的实验设计。

图4｜案例二：RB-EGFP（罗丹明标记绿色荧光蛋白）