《MedComm》：四川大学造出「蓝光一照就变硬「的载药凝胶，MIF siRNA+GDNF双弹原位缓释，完全横断脊髓损伤小鼠后肢重新落地

◆ 一、双药装载：阳离子NP包siRNA，化学接枝固定GDNF

先说载体本身。脂质纳米颗粒（NP）按DOTAP（阳离子脂）:胆固醇=1:1摩尔比氯仿溶解、60°C旋蒸成膜、5%葡萄糖水化、950 W超声（开5 s/停5 s）2 min制备：粒径51.51±3.2 nm、电位+41.97±1.2 mV，球形均一，在293T与RAW264.7细胞中活力优于25 kDa PEI（经典阳性对照）。N/P重量比4:1即可完全结合siRNA；形成siRNA/NP复合物后粒径升至144.3±11.55 nm（电镜平均约120 nm）、电位维持+49.46 mV；RNase降解实验里，裸siRNA早已被啃干净，复合物条带仍清晰——NP是合格的"防弹衣"。GDNF则走另一条路：小鼠GDNF截短体（113–211 aa）连gp67信号肽、10×His、Sumo标签与TEV酶切位点克隆入pFastBac1，Sf9细胞+Bac-to-Bac杆状病毒系统表达，Ni亲和层析、TEV切标签、HiTrap Q阴离子交换、Superdex 200分子筛四级纯化，得到单体-二聚体混合物。凝胶基座是明胶甲基丙烯酰（GM，GelMA）：I型猪皮明胶10 g/100 mL PBS与8%质量分数甲基丙烯酸酐反应3 h、透析一周冻干，配成5%溶液加0.25%可见光引发剂LAP。GDNF先用MAL-PEG2000-NHS做迈克尔加成（GDNF的-SH接马来酰亚胺，NHS端接凝胶的氨基）化学锚定到GM上，再与siRNA、NP、LAP混合，405 nm蓝光30 s即可固化成型。

◆ 二、降解与释放：78 h降解完，7天后释放的siRNA仍能沉默80%的MIF

用FITC-GDNF与Cy3-siRNA双标追踪释放过程：支架在78 h完全降解并同步释药；与游离GDNF相比，负载于支架的GDNF在第5天释放速率显著放缓；siRNA方面，初始投入1 µg，PLNG支架7天后储存量仍>0.8 µg，而仅用NP包裹的siRNA几乎损失一半。更关键的是"放出来的药还是药"：7天洗脱上清转染RAW264.7细胞，转染荧光强且无明显细胞毒，MIF mRNA相对表达被压到对照的40%——缓释全程保持生物活性，一次给药覆盖数天（图1）。

支架制备表征：NP/siRNA粒径电位、SEM微结构、78 h降解与GDNF/siRNA七日缓释

◆ 三、体外双效：巨噬细胞从M1翻向M2，脊髓原代神经元轴突长2倍

siMIF/NP在HT22（神经元系）与RAW264.7中都能高效转染（Cy3强阳性）；LPS刺激的RAW264.7里，siMIF/NP使MIF mRNA降50%，流式显示M1型（F4/80⁺CD86⁺，促炎）占25.83%、M2型（F4/80⁺CD206⁺，修复型）升至17.16%——MIF沉默把巨噬细胞从"火上浇油"推向"收拾残局"。因子层面：TNF-α、IL-1β（两大促炎主力）降到0.5倍/2倍方向，而IL-10升22倍、IL-4升3.3倍（抗炎/修复型因子）。GDNF这一半的功能同样直接：原代脊髓神经元24 h即见轴突开始生长，48 h满视野都是生长中的轴突；NF-160（神经丝中链蛋白，轴突骨架标志）染色下长轴突的神经元数目远超对照（对照仅1–2个）；分枝点数、分支级数、总分枝数与突起总长分别为对照的2倍、1.3倍、2倍与2倍。一支针剂，两种细胞各取所需（图2）。

siMIF/NP促M2极化与抗炎因子上调；GDNF促原代脊髓神经元轴突生长与分枝量化

◆ 四、行为学：第4天开始恢复，BMS打到3–4分，足迹出现完全足底踏地

疗效实验用T9–T10全横断模型（显微剪离断脊髓），7周龄BALB/c每组10只：SCI组、GDNF-GM组（35 µg GDNF）、PLNG/siMIF组（35 µg siMIF+140 µg NP）与联合GDNF-PLNG/siMIF组。首次给药开皮肤注入损伤灶、即刻蓝光固化30 s成胶；第7天起第2、3次给药无需再切开，经皮注射到伤处光照固化即可。BMS评分（开放场后肢运动21分制，看关节活动、足底踏地与步态协调）：联合组第4天即开始恢复，三剂后达3–4分，高于两个单药组，SCI组全程无恢复。后肢表型：SCI组双肢瘫痪伴 toe curling（足趾蜷缩），联合组左后足强有力展开、偶见负重足底踏地，右后肢出现踝关节活动。足迹实验（前肢红墨水、后肢蓝墨水）：SCI组轨迹弯曲、印迹粗钝，两个单药组轨迹趋直但仅划步（sweeping）无踏地，联合组轨迹笔直、足印清晰、出现足底踏地，步宽、步长与足印面积接近正常——这是"能踩下去"的质变（图3）。

◆ 五、组织修复：横断处不再断开，髓鞘保持完整

取材照片：联合组脊髓结构完整、病灶处未见横断缺损。H&E系列切片：联合组组织相连且形态整合，为神经传导重建提供通路；Luxol Fast Blue（LFB，铜酞菁类染料，专染髓鞘磷脂）染色：SCI、GDNF-GM与PLNG/siMIF三组髓鞘破损不整，联合组髓鞘轮廓清晰完整。免疫荧光三项抑制性指标全线回落：CD68⁺（巨噬细胞）与Iba1⁺（小胶质/巨噬细胞）在联合组病灶区显著减少；GFAP⁺（星形胶质细胞标志，胶质瘢痕主力）在SCI组弥漫高亮、联合组显著降低——既抗炎又抑制胶质瘢痕（图4）。神经元端：Tubulin（β-tubulin III，神经元分化早期标志）在联合组病灶区最多，NeuN⁺（成熟神经元核抗原）荧光强度最强，CD31⁺（血管内皮）细胞显著增多，提示新生血管与神经元重塑同步发生，主要脏器HE无显著毒性（图5）。

◆ 六、蛋白组揭底：656 vs 32，联合治疗调动的蛋白是单药的"军团级"

Astral DIA定量蛋白组给出分子级答案：与SCI组比较，联合组差异蛋白多达656种，GDNF-GM与PLNG/siMIF分别只有283与305种；三组交集仅32种——联合方案召唤出一支单药根本凑不出的"修复军团"。差异蛋白中联合组577上调、80下调；上调端富集组织修复与信号转导功能分子：Col3a1、Col1a1、Col1a2（三型/一型胶原，细胞外基质与修复支架）、Fn1（纤连蛋白，细胞迁移轨道）、Anxa1（膜联蛋白A1，促炎症消退）；下调端富集炎症调控蛋白：Naip5、Adcy2、Map3k7（NF-κB炎症小体关联、cAMP信号与MAPK级联上游）。GO与KEGG注释：联合组在组织修复与炎症调控类注释达21种，通路富集集中于PI3K-Akt、MAPK与TNF信号——与"胶原/整合素上调+促炎通路熄火"的行为学表型闭环（图6）。

蛋白组学：联合组656种差异蛋白（交集仅32），Col3a1/Fn1上调、Naip5/Map3k7下调，富集PI3K-Akt/MAPK/TNF

单药GO各有侧重（PLNG/siMIF偏适应性免疫，GDNF-GM偏免疫应答与细胞因子调控），联合组同时拿下免疫应答与种间互作/信号转导（图6、图7）。

本研究把"siRNA抗炎（MIF→M2极化）"与"蛋白促再生（GDNF→轴突生长）"两条腿装进同一支可注射、光固化的PLNG凝胶，78 h降解、7天缓释全程保活，让完全横断小鼠从瘫痪走到足底踏地、病灶从断裂走到结构连续，并用656种差异蛋白（远超单药）重写了PI3K-Akt/MAPK/TNF的免疫版图。它的框架极具可迁移性：把siMIF换成任意炎症靶点siRNA、把GDNF换成NT-3或NGF，同一光固化逻辑就能配出针对脑卒中、外周神经损伤甚至骨关节缺损的"原位药库"——打一针、照三十秒蓝光，把药留在最该待的地方。

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本文的siRNA-LNP制备、GDNF蛋白表达纯化与凝胶缓释表征，都在纳米医学网（Sunlipo Biotech，www.med-nanotech.com）服务目录中：脂质体与LNP递送系统构建、核酸药物（siRNA）递送设计、重组蛋白表达纯化、磷脂-PEG-靶分子偶联物（MAL-PEG-NHS类）定制、粒径电位/TEM表征检测、体内分布与临床前药效/安全性评价——"设计→制备→表征→动物验证"一站式交付。

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参考资料：https://doi.org/10.1002/mco2.70099
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（本文配图缺失，发布时需从原文 https://doi.org/10.1002/mco2.70099 手动截图）

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